【摘要】：一、研究背景和研究目的阪崎克羅諾桿菌(Cronobacter sakazakii,C.sakazakii)屬于革蘭陰性腸桿菌,臨床上主要引起早產(chǎn)兒和低體重新生兒細(xì)菌性腦膜炎和壞死性小腸結(jié)腸炎(necrotizing enterocolitis,NEC),嚴(yán)重危害新生兒生命安全。C.sakazakii主要通過受污染奶粉以及手術(shù)器械進(jìn)行傳播,目前研究多集中于建立新型檢測(cè)技術(shù),對(duì)于其致病機(jī)制報(bào)道較少。NEC是炎癥性疾病,核苷酸寡聚結(jié)合域樣受體家族(NOD-like receptors,NLRs)參與多種腸道炎癥,因此推測(cè)C.sakazakii引起NEC與NLRs具有相關(guān)性。而 NOD 樣受體蛋白 3(NOD like receptor protein 3,NLRP3)是 NLRs中主要作用形式。在機(jī)體受到刺激后,NLRP3與半胱氨酸蛋白酶1(Cysteiny1 aspartate specific proteinase-1,Caspase-1)以及凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白(Apoptosis-associated speck-like protein containing CARD,ASC)形成三聚體,一方面刺激炎癥因子成熟,另一方面促進(jìn)焦亡相關(guān)蛋白gasdermin D(GSDMD)活化,兩者共同介導(dǎo)腸道炎癥。此外作為機(jī)體適應(yīng)性免疫反應(yīng)的Toll樣受體(TLRs)也與炎癥發(fā)生密切相關(guān),尤其Toll樣受體4(Toll-like receptor 4,TLR4)通過和脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)結(jié)合介導(dǎo)下游核轉(zhuǎn)錄因子κB(Nuclear factor kappa light chain enhancer of activated B cells,NF-κB)入核,而 NF-κB 激活,可上調(diào) NLRP3、白介素 1β(Interleukin 1β,IL-1β)和白介素 18(Interleukin 18,IL-18)的表達(dá),從而調(diào)控炎癥小體。因此炎癥小體和TLR4之間存在密切聯(lián)系,兩者可能共同介導(dǎo)炎癥的發(fā)生。鑒于此,本實(shí)驗(yàn)建立C.sakazakii致NEC體內(nèi)外模型,探討C.sakazakii致NEC是否通過TLR4介導(dǎo),激活炎癥小體NLRP3,引起細(xì)胞焦亡,釋放炎癥因子IL-1β,從而引發(fā)炎癥。本研究將為C.sakazakii的致病機(jī)制和新的治療靶點(diǎn)提供研究基礎(chǔ)。二、研究方法1.設(shè)置C.sakazakii模型組和PBS對(duì)照組,采用人結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29以及SD新生大鼠,建立C.sakazakii致NEC體內(nèi)外模型,使用臺(tái)盼藍(lán)染色、PI染色、細(xì)胞周期檢測(cè)以及組織病理切片HE染色,明確C.sakazakii的致病性。2.利用Western blot、Q-PCR,對(duì)體內(nèi)外NEC模型中NLRP3相關(guān)蛋白及下游炎癥因子進(jìn)行檢測(cè),明確炎癥小體NLRP3在C.sakazakii致NEC中的作用。3.利用Western blot、免疫組化等對(duì)TLR4通路相關(guān)蛋白進(jìn)行檢測(cè),探究C.sakazakii致NEC中TLR4和炎癥小體NLRP3之間的關(guān)系,明確炎癥小體NLRP3是否通過TLR4/NF-κB的調(diào)控從而介導(dǎo)NEC。三.研究結(jié)果1.體外模型結(jié)果顯示C.sakazakii能夠?qū)T-29細(xì)胞造成損傷,與對(duì)照組之間存在顯著差異,同時(shí)細(xì)胞周期結(jié)果顯示其可抑制細(xì)胞增殖;體內(nèi)模型組,腸腔充氣明顯,腸管明顯膨大;HE染色顯示模型組腸道組織結(jié)構(gòu)不完整,微絨毛稀薄,出現(xiàn)部分脫落、壞死,病理損傷明顯,對(duì)照組沒有出現(xiàn)明顯病理變化。2.WB結(jié)果顯示體內(nèi)外模型組,炎癥小體NLRP3相關(guān)蛋白(NLRP3、ASC、Caspase-1)、下游炎癥因子IL-1 β及焦亡蛋白GSDMD-NT表達(dá)均上調(diào),與對(duì)照組之間具有顯著差異;同時(shí)體外阻斷NLRP3后,阻斷組相比模型組,IL-1β mRNA轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)。3.WB和免疫組化結(jié)果顯示模型組TLR4及下游MyD88的表達(dá)量上調(diào),與對(duì)照組之間具有顯著差異;同時(shí)體外阻斷TLR4后,阻斷組相比模型組Caspase-1蛋白表達(dá)和IL-1β mRNA表達(dá)下降。四、結(jié)論C.sakazakii通過與腸上皮細(xì)胞表面TLR4結(jié)合,活化MyD88途徑,調(diào)節(jié)下游NF-κBp65入核,激活NLRP3炎癥小體,促進(jìn)IL-1β成熟,誘導(dǎo)GSDMD表達(dá),引起細(xì)胞焦亡,導(dǎo)致NEC。
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R722.1
【圖文】：

逑行計(jì)數(shù)，通過分析發(fā)現(xiàn)，模型組中陽性細(xì)胞數(shù)明顯高于空白組中陽性細(xì)胞數(shù)，逡逑兩者之間存在顯著差異（Ｐ＜0．0５）。見圖１－１，１－２。逡逑｜５｜、’邐＇邋＇邐＾逡逑圖１－１．臺(tái)盼藍(lán)染色鏡下檢測(cè)２９５４４對(duì)ＨＴ－２９細(xì)胞損傷逡逑Ｆｉｇ．１－１．邋Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ邋ｏｆＨＴ－２９邋ｃｅｌｌ邋ｄａｍａｇｅ邋ｂｙ邋ｔｒｙｐａｎ邋ｂｌｕｅ邋ｓｔａｉｎｉｎｇ邋Ａ．ｃｏｎｔｒｏｌ邋ｇｒｏｕｐ邋Ｂ．ＮＥＣ逡逑ｍｏｄｅｌ邋ｇｒｏｕｐ逡逑５０－｜邐邐＊邐■逡逑■丨＿邐＿逡逑Ｃｏｎｔｒｏｌ邐２９５４４逡逑圖１－２．臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)檢測(cè)２９５４４對(duì)ＨＴ－２９細(xì)胞損傷逡逑Ｆｉｇ．邋１－２．邋Ｎｕｍｂｅｒ邋ｏｆＨＴ－２９邋ｃｅｌｌ邋ｄａｍａｇｅ邋ｃｏｕｎｔｓ邋ｂｙ邋Ｔｒｙｐａｎ邋ｂｌｕｅ邋ｓｔａｉｎｉｎｇ逡逑２．２細(xì)胞損傷ｎ染色檢測(cè)結(jié)果逡逑在ｐｉ染色實(shí)驗(yàn)中，首先通過白光選定數(shù)量差異不大的區(qū)域，可以看到空白逡逑組和２９５４４處理組中觀察細(xì)胞數(shù)量沒有明顯差異。隨后我們通過熒光顯微鏡鏡逡逑下觀察陽性細(xì)胞（紅色熒光）數(shù)量，可以看到在２９５４４處理組中，陽性細(xì)胞數(shù)逡逑量明顯小于空白組中中陽性細(xì)胞數(shù)。如圖１－３。逡逑１４逡逑

逑行計(jì)數(shù)，通過分析發(fā)現(xiàn)，模型組中陽性細(xì)胞數(shù)明顯高于空白組中陽性細(xì)胞數(shù)，逡逑兩者之間存在顯著差異（Ｐ＜0．0５）。見圖１－１，１－２。逡逑｜５｜、’邐＇邋＇邐＾逡逑圖１－１．臺(tái)盼藍(lán)染色鏡下檢測(cè)２９５４４對(duì)ＨＴ－２９細(xì)胞損傷逡逑Ｆｉｇ．１－１．邋Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ邋ｏｆＨＴ－２９邋ｃｅｌｌ邋ｄａｍａｇｅ邋ｂｙ邋ｔｒｙｐａｎ邋ｂｌｕｅ邋ｓｔａｉｎｉｎｇ邋Ａ．ｃｏｎｔｒｏｌ邋ｇｒｏｕｐ邋Ｂ．ＮＥＣ逡逑ｍｏｄｅｌ邋ｇｒｏｕｐ逡逑５０－｜邐邐＊邐■逡逑■丨＿邐＿逡逑Ｃｏｎｔｒｏｌ邐２９５４４逡逑圖１－２．臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)檢測(cè)２９５４４對(duì)ＨＴ－２９細(xì)胞損傷逡逑Ｆｉｇ．邋１－２．邋Ｎｕｍｂｅｒ邋ｏｆＨＴ－２９邋ｃｅｌｌ邋ｄａｍａｇｅ邋ｃｏｕｎｔｓ邋ｂｙ邋Ｔｒｙｐａｎ邋ｂｌｕｅ邋ｓｔａｉｎｉｎｇ逡逑２．２細(xì)胞損傷ｎ染色檢測(cè)結(jié)果逡逑在ｐｉ染色實(shí)驗(yàn)中，首先通過白光選定數(shù)量差異不大的區(qū)域，可以看到空白逡逑組和２９５４４處理組中觀察細(xì)胞數(shù)量沒有明顯差異。隨后我們通過熒光顯微鏡鏡逡逑下觀察陽性細(xì)胞（紅色熒光）數(shù)量，可以看到在２９５４４處理組中，陽性細(xì)胞數(shù)逡逑量明顯小于空白組中中陽性細(xì)胞數(shù)。如圖１－３。逡逑１４逡逑

逡逑＿＿逡逑圖１－３．ＰＩ染色檢測(cè)２９５４４對(duì)ＨＴ－２９細(xì)胞損傷作用逡逑Ｆｉｇ．１－３．邋Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｂａｃｔｅｒｉａｌ邋ｄａｍａｇｅ邋ｔｏ邋ＨＴ－２９邋ｃｅｌｌｓ邋ｂｙ邋ＰＩ邋ｓｔａｉｎｉｎｇ（２００ｘ）邋Ａ，Ｂ邋ｃｏｎｔｒｏｌ邋ｇｒｏｕｐ．Ｃ．Ｄ逡逑２９５４４邋ｇｒｏｕｐ逡逑２．３體外損傷細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果逡逑從細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果可以看出，正常組中處于Ｇ１細(xì)胞百分比為３２．８５％，逡逑其中處于Ｓ期的細(xì)胞數(shù)量為４５．０６％，處于Ｇ２期細(xì)胞數(shù)量為２２．０９％。造模組中逡逑處于Ｇ１細(xì)胞百分比為４４．０６％，處于Ｓ期的細(xì)胞數(shù)量為４２．４９％，處于Ｇ２期細(xì)逡逑胞數(shù)量為１３．４５％。阪崎克羅諾桿菌主要是阻斷細(xì)胞的Ｇ１期以及Ｇ２期。如圖逡逑１－４。逡逑Ｉ］邐ＩＩ？邋１．邋Ｔ邐屋邋Ｓ逡逑■邐姫蝴邐Ｉ逡逑１：邋Ｉ邋Ｉ；：逡逑＾邋＿邐■邐２２，０９％逡逑：Ｌ－ｗＬ逡逑°邐？邐６０邐Ｓ３邐１００邐0

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本文編號(hào)：2773320