發(fā)布時間：2020-07-28 21:28

【摘要】：法布萊氏病(Fabry disease),是一種罕見的X染色體連鎖遺傳的鞘糖脂類代謝疾病,由定位于Xq22的α-半乳糖苷酶A(α-galactosidase A,GLA或α-Gal A)基因突變造成[1]。α-半乳糖苷酶A(α-galactosidase A,GLA)的缺失可導(dǎo)致其底物球形三脂酰基鞘鞍醇(Gb3)和糖苷神經(jīng)鞘脂類在全身細胞、組織和器官中累積,引起血液循環(huán)障礙并進一步導(dǎo)致心、腎功能衰竭和神經(jīng)系統(tǒng)紊亂而死亡[2]。法布萊氏病的發(fā)病率為1/4000~1/11700[3],大多在兒童和青少年時期發(fā)作,若不及時治療,一般在40歲左右就會死亡。 酶替代療法是目前治療法布萊氏病最有效的方法[4]。而獲得足量、高活性的GLA是進行酶替代療法的關(guān)鍵。由于GLA是一種糖蛋白,糖基化對其功能的影響至關(guān)重要,而哺乳動物細胞表達系統(tǒng)的糖基化修飾功能與人類相同,是表達GLA系統(tǒng)的首選體系,但存在表達量低的缺陷。這成為本實驗的一個制約因素。據(jù)文獻報道[5],mRNA5’非翻譯區(qū)和編碼區(qū)的核苷酸序列的改變,能有效的提高其翻譯效率。據(jù)此,我們擬通過改變GLA mRNA編碼區(qū)的核苷酸序列來提高蛋白的表達效率。首先,構(gòu)建含野生型和突變型GLA基因的真核表達載體并轉(zhuǎn)染哺乳動物細胞,篩選獲得高表達GLA的單克隆細胞。其次,優(yōu)化GLA蛋白誘導(dǎo)表達的條件,大規(guī)模培養(yǎng)高表達GLA的宿主細胞。再次,建立GLA分離、純化的方法,獲得高純度的GLA。最后,對重組GLA的理化性質(zhì)及生化特性進行初步分析。主要研究內(nèi)容及研究結(jié)果有: 1.重組質(zhì)粒的構(gòu)建 通過RT-PCR方法從SMMC-7721細胞中克隆cDNA。設(shè)計引物,擴增野生型GLA基因及突變型GLA基因(起始密碼子后的第一個堿基由胞嘧啶突變?yōu)轼B嘌呤)。將擴增的基因連接到真核表達載體pcDNA3.1/myc-His A質(zhì)粒(在C末端含有6×His標簽,這方便后續(xù)的純化;含有新霉素(neomycin)基因,易于對陽性克隆的篩選)上。經(jīng)酶切鑒定及測序分別證實我們獲得了含野生型和突變型GLA基因的重組質(zhì)粒,并將其命名為pcDNA3.1/myc-His A-GLA和pcDNA3.1/myc-His A-mutation-GLA。 2.陽性克隆的篩選及誘導(dǎo)條件的優(yōu)化 將構(gòu)建的重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染CHO細胞和HEK293細胞,經(jīng)用G418篩選獲得4種抗性克隆。檢測各種克隆表達的GLA活性,從每種克隆中各選擇一株GLA活性最高單克隆細胞,將轉(zhuǎn)染野生型和突變型GLA基因的CHO細胞分別命名為CHO(GLA)和CHO(m-GLA),轉(zhuǎn)染野生型和突變型GLA基因的HEK293細胞分別命名為HEK293(GLA)和HEK293(m-GLA)。將這4株單克隆細胞以相同的條件培養(yǎng),并加丁酸鈉誘導(dǎo)72h,檢測培養(yǎng)上清分泌的蛋白活性,發(fā)現(xiàn)CHO(GLA)、CHO(m-GLA)、HEK293(GLA)和HEK293(m-GLA)培養(yǎng)上清的GLA蛋白活性分別為:8.3×10~6、14.2×10~6、0.5×10~6和1.4×10~6U/L�？梢�,對于同種宿主細胞,轉(zhuǎn)染含突變型GLA基因質(zhì)粒的細胞比轉(zhuǎn)染含野生型GLA基因質(zhì)粒的細胞培養(yǎng)上清的GLA活性明顯要高;而且轉(zhuǎn)染同種質(zhì)粒后,對CHO細胞來說,表達蛋白的活性也明顯高于HEK293細胞。隨后我們對CHO(GLA)和CHO(m-GLA)細胞密度、誘導(dǎo)劑量及誘導(dǎo)時間等條件進行優(yōu)化,得出在6孔板中每孔培養(yǎng)50萬個細胞效果最好,細胞密度過高,空間不足;密度過低,蛋白表達量不高。對于丁酸鈉劑量,誘導(dǎo)劑量較低時,表達量則很低,劑量升高時蛋白表達量也隨之升高,當(dāng)濃度高于10mmol/L時,蛋白表達量沒有明顯升高。隨著誘導(dǎo)時間的延長,蛋白表達量會升高,在60h左右達到最高值,若時間過長,一方面,細胞會死亡;另一方面,表達的蛋白易于失活。所以我們選擇60h作為最佳誘導(dǎo)時間。 3.表達產(chǎn)物的鑒定 擴大培養(yǎng)CHO(GLA)和CHO(m-GLA)細胞,10mmol/L丁酸鈉誘導(dǎo)60h后,收集培養(yǎng)上清,并用HisTrap~(TM) FF柱純化。純化后的樣品經(jīng)SDS-PAGE分析,發(fā)現(xiàn)在50kd附近有清晰的條帶,與GLA相符,提示純化產(chǎn)物可能是重組的GLA蛋白。經(jīng)灰度掃描,純度分別為95.2%(野生型GLA)和95.8%(突變型GLA),說明產(chǎn)物純度較高。由于構(gòu)建的載體在C末端含有6×His標簽,我們接著對純化的樣品分別用抗GLA和抗6×His的抗體進行蛋白免疫印跡分析,發(fā)現(xiàn)兩種抗體均可在50kd附近檢測到明顯的信號,進一步表明純化產(chǎn)物為重組GLA蛋白。對純化前后蛋白比活性的比較發(fā)現(xiàn),在純化前突變型和野生型GLA比活性分別為0.0029×10~6和0.0316×10~6U/mg;純化之后的野生型GLA的比活性(0.69×10~6U/mg)與商品化的GLA(0.77×10~6U/mg)相當(dāng),而突變型GLA的比活性(1.78×10~6U/mg)則是商品化的GLA的2.3倍,提示突變型GLA的蛋白活性是野生型的2-3倍。由于純化前突變型GLA的比活性大約是野生型GLA的10倍,提示基因突變除了能夠顯著增加GLA蛋白活性外,還能提高mRNA的翻譯效率。 4.GLA生化性質(zhì)的研究 對純化后的樣品,我們測定其相對分子量、最適反應(yīng)pH、最適反應(yīng)溫度及酶反應(yīng)動力學(xué)參數(shù)Km和Vmax等生化性質(zhì)。通過質(zhì)譜分析,野生型和突變型GLA分子量分別是54.9×10~3和54.8×10~3,略大于推算的分子量,這可能是由GLA糖基化引起的。其最適反應(yīng)pH在4.6附近,與標準品相似。兩者最適反應(yīng)溫度隨著溫度的升高逐漸增強,在37℃時達到最大,這點也與標準品相似,但標準品在較低溫度時酶的活性比我們表達的兩種GLA活性略高。通過對米氏常數(shù)和最大反應(yīng)速度的研究,我們發(fā)現(xiàn)野生型GLA的Km為2.39μmol/L, Vmax為0.0034μmol/min;突變型GLA的Km為1.27μmol/L, Vmax為0.0036μmol/min;標準品Km為3.45μmol/L, Vmax為0.0045μmol/min。提示突變型GLA對底物的親和力最高,標準品對底物的親和力最低,但標準品比其他兩者的Vmax要略高,這也解釋了突變型GLA比野生型GLA的比活高的原因。 以上結(jié)果表明,我們通過定點突變的方法構(gòu)建了含突變型GLA基因的重組質(zhì)粒,并且轉(zhuǎn)染CHO細胞和HEK293細胞,獲得表達高活性GLA的單克隆細胞,其中轉(zhuǎn)染突變型GLA基因的CHO細胞[CHO(m-GLA)]的GLA表達水平最高。我們優(yōu)化了單克隆細胞誘導(dǎo)表達條件并進行大規(guī)模培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)CHO(m-GLA)細胞培養(yǎng)上清的GLA比活性是CHO(GLA)細胞的10倍。收集并純化培養(yǎng)上清,SDS-PAGE和蛋白免疫印跡鑒定,證實通過一步親和層析即可獲得較高純度的GLA蛋白。對純化產(chǎn)品的活性及理化性質(zhì)分析結(jié)果顯示,突變型GLA蛋白的主要生化性質(zhì)沒有發(fā)生改變,但對底物的親和力及活性明顯提高,推斷突變不僅可以增加GLA mRNA的翻譯水平,而且可引起蛋白空間結(jié)構(gòu)的改變,從而提高GLA的活性�？傊�,我們獲得了高表達突變型GLA的CHO細胞株,并且重組GLA高純度、高活性,為下一步生產(chǎn)重組GLA并最終用于法布萊氏病的治療奠定了堅實的基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R725.9
【圖文】：

進行 PCR 擴增，通過 1%瓊脂糖凝膠電泳分析，得到了預(yù)期大小為 1300kb左右的產(chǎn)物(圖 1-1)。圖1-1 人GLAcDNA的PCR擴增產(chǎn)物A.野生型GLA基因擴增；B.突變型GLA基因擴增；M. DNA標志物 DL2000；1~2. PCR擴增目的片段1.3.2 人 GLA 重組質(zhì)粒的構(gòu)建用 EcoRⅠ、XholⅠ分別對兩種 PCR 產(chǎn)物及 pcDNA3.1/myc-His A 質(zhì)粒進行50003000200010007505002501005000300020001000750500250100A bp M 1 2 Bbp M 1 2

第一部分 重組質(zhì)粒的構(gòu)建收目的基因片段和表達載體基因，并用 T4 連接酶將其連接， 1-2)。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化 DH5α 感受態(tài)細胞，篩選陽性菌落，搖經(jīng) EcoRⅠ、XholⅠ雙酶切，在重組質(zhì)粒上均可獲得 1300kb 左測序結(jié)果表明兩個重組質(zhì)粒分別含有野生型和突變型的 GLA-4)，分別命名為 pcDNA3.1/myc-His A-GLA 和 pcDNA3.1-GLA。

圖 1-4(A) 野生型 GLA 基因測序圖譜bpM 1 2 3圖1-3 重組質(zhì)粒的酶切鑒定M. DNA 標志物 DL2000；1.pcDNA3.1/myc-His A-GLA質(zhì)粒酶切產(chǎn)物;2.pcDNA3.1/myc-His A-mutation-GLA質(zhì)粒酶切產(chǎn)物;3.空載體酶切產(chǎn)物.

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本文編號：2773458