【摘要】：法布萊氏病(Fabry disease),是一種罕見(jiàn)的X染色體連鎖遺傳的鞘糖脂類(lèi)代謝疾病,由定位于Xq22的α-半乳糖苷酶A(α-galactosidase A,GLA或α-Gal A)基因突變?cè)斐蒣1]。α-半乳糖苷酶A(α-galactosidase A,GLA)的缺失可導(dǎo)致其底物球形三脂�；拾按�(Gb3)和糖苷神經(jīng)鞘脂類(lèi)在全身細(xì)胞、組織和器官中累積,引起血液循環(huán)障礙并進(jìn)一步導(dǎo)致心、腎功能衰竭和神經(jīng)系統(tǒng)紊亂而死亡[2]。法布萊氏病的發(fā)病率為1/4000~1/11700[3],大多在兒童和青少年時(shí)期發(fā)作,若不及時(shí)治療,一般在40歲左右就會(huì)死亡。 酶替代療法是目前治療法布萊氏病最有效的方法[4]。而獲得足量、高活性的GLA是進(jìn)行酶替代療法的關(guān)鍵。由于GLA是一種糖蛋白,糖基化對(duì)其功能的影響至關(guān)重要,而哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的糖基化修飾功能與人類(lèi)相同,是表達(dá)GLA系統(tǒng)的首選體系,但存在表達(dá)量低的缺陷。這成為本實(shí)驗(yàn)的一個(gè)制約因素。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[5],mRNA5’非翻譯區(qū)和編碼區(qū)的核苷酸序列的改變,能有效的提高其翻譯效率。據(jù)此,我們擬通過(guò)改變GLA mRNA編碼區(qū)的核苷酸序列來(lái)提高蛋白的表達(dá)效率。首先,構(gòu)建含野生型和突變型GLA基因的真核表達(dá)載體并轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞,篩選獲得高表達(dá)GLA的單克隆細(xì)胞。其次,優(yōu)化GLA蛋白誘導(dǎo)表達(dá)的條件,大規(guī)模培養(yǎng)高表達(dá)GLA的宿主細(xì)胞。再次,建立GLA分離、純化的方法,獲得高純度的GLA。最后,對(duì)重組GLA的理化性質(zhì)及生化特性進(jìn)行初步分析。主要研究?jī)?nèi)容及研究結(jié)果有: 1.重組質(zhì)粒的構(gòu)建 通過(guò)RT-PCR方法從SMMC-7721細(xì)胞中克隆cDNA。設(shè)計(jì)引物,擴(kuò)增野生型GLA基因及突變型GLA基因(起始密碼子后的第一個(gè)堿基由胞嘧啶突變?yōu)轼B(niǎo)嘌呤)。將擴(kuò)增的基因連接到真核表達(dá)載體pcDNA3.1/myc-His A質(zhì)粒(在C末端含有6×His標(biāo)簽,這方便后續(xù)的純化;含有新霉素(neomycin)基因,易于對(duì)陽(yáng)性克隆的篩選)上。經(jīng)酶切鑒定及測(cè)序分別證實(shí)我們獲得了含野生型和突變型GLA基因的重組質(zhì)粒,并將其命名為pcDNA3.1/myc-His A-GLA和pcDNA3.1/myc-His A-mutation-GLA。 2.陽(yáng)性克隆的篩選及誘導(dǎo)條件的優(yōu)化 將構(gòu)建的重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞和HEK293細(xì)胞,經(jīng)用G418篩選獲得4種抗性克隆。檢測(cè)各種克隆表達(dá)的GLA活性,從每種克隆中各選擇一株GLA活性最高單克隆細(xì)胞,將轉(zhuǎn)染野生型和突變型GLA基因的CHO細(xì)胞分別命名為CHO(GLA)和CHO(m-GLA),轉(zhuǎn)染野生型和突變型GLA基因的HEK293細(xì)胞分別命名為HEK293(GLA)和HEK293(m-GLA)。將這4株單克隆細(xì)胞以相同的條件培養(yǎng),并加丁酸鈉誘導(dǎo)72h,檢測(cè)培養(yǎng)上清分泌的蛋白活性,發(fā)現(xiàn)CHO(GLA)、CHO(m-GLA)、HEK293(GLA)和HEK293(m-GLA)培養(yǎng)上清的GLA蛋白活性分別為:8.3×10~6、14.2×10~6、0.5×10~6和1.4×10~6U/L�？梢�(jiàn),對(duì)于同種宿主細(xì)胞,轉(zhuǎn)染含突變型GLA基因質(zhì)粒的細(xì)胞比轉(zhuǎn)染含野生型GLA基因質(zhì)粒的細(xì)胞培養(yǎng)上清的GLA活性明顯要高;而且轉(zhuǎn)染同種質(zhì)粒后,對(duì)CHO細(xì)胞來(lái)說(shuō),表達(dá)蛋白的活性也明顯高于HEK293細(xì)胞。隨后我們對(duì)CHO(GLA)和CHO(m-GLA)細(xì)胞密度、誘導(dǎo)劑量及誘導(dǎo)時(shí)間等條件進(jìn)行優(yōu)化,得出在6孔板中每孔培養(yǎng)50萬(wàn)個(gè)細(xì)胞效果最好,細(xì)胞密度過(guò)高,空間不足;密度過(guò)低,蛋白表達(dá)量不高。對(duì)于丁酸鈉劑量,誘導(dǎo)劑量較低時(shí),表達(dá)量則很低,劑量升高時(shí)蛋白表達(dá)量也隨之升高,當(dāng)濃度高于10mmol/L時(shí),蛋白表達(dá)量沒(méi)有明顯升高。隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng),蛋白表達(dá)量會(huì)升高,在60h左右達(dá)到最高值,若時(shí)間過(guò)長(zhǎng),一方面,細(xì)胞會(huì)死亡;另一方面,表達(dá)的蛋白易于失活。所以我們選擇60h作為最佳誘導(dǎo)時(shí)間。 3.表達(dá)產(chǎn)物的鑒定 擴(kuò)大培養(yǎng)CHO(GLA)和CHO(m-GLA)細(xì)胞,10mmol/L丁酸鈉誘導(dǎo)60h后,收集培養(yǎng)上清,并用HisTrap~(TM) FF柱純化。純化后的樣品經(jīng)SDS-PAGE分析,發(fā)現(xiàn)在50kd附近有清晰的條帶,與GLA相符,提示純化產(chǎn)物可能是重組的GLA蛋白。經(jīng)灰度掃描,純度分別為95.2%(野生型GLA)和95.8%(突變型GLA),說(shuō)明產(chǎn)物純度較高。由于構(gòu)建的載體在C末端含有6×His標(biāo)簽,我們接著對(duì)純化的樣品分別用抗GLA和抗6×His的抗體進(jìn)行蛋白免疫印跡分析,發(fā)現(xiàn)兩種抗體均可在50kd附近檢測(cè)到明顯的信號(hào),進(jìn)一步表明純化產(chǎn)物為重組GLA蛋白。對(duì)純化前后蛋白比活性的比較發(fā)現(xiàn),在純化前突變型和野生型GLA比活性分別為0.0029×10~6和0.0316×10~6U/mg;純化之后的野生型GLA的比活性(0.69×10~6U/mg)與商品化的GLA(0.77×10~6U/mg)相當(dāng),而突變型GLA的比活性(1.78×10~6U/mg)則是商品化的GLA的2.3倍,提示突變型GLA的蛋白活性是野生型的2-3倍。由于純化前突變型GLA的比活性大約是野生型GLA的10倍,提示基因突變除了能夠顯著增加GLA蛋白活性外,還能提高mRNA的翻譯效率。 4.GLA生化性質(zhì)的研究 對(duì)純化后的樣品,我們測(cè)定其相對(duì)分子量、最適反應(yīng)pH、最適反應(yīng)溫度及酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)Km和Vmax等生化性質(zhì)。通過(guò)質(zhì)譜分析,野生型和突變型GLA分子量分別是54.9×10~3和54.8×10~3,略大于推算的分子量,這可能是由GLA糖基化引起的。其最適反應(yīng)pH在4.6附近,與標(biāo)準(zhǔn)品相似。兩者最適反應(yīng)溫度隨著溫度的升高逐漸增強(qiáng),在37℃時(shí)達(dá)到最大,這點(diǎn)也與標(biāo)準(zhǔn)品相似,但標(biāo)準(zhǔn)品在較低溫度時(shí)酶的活性比我們表達(dá)的兩種GLA活性略高。通過(guò)對(duì)米氏常數(shù)和最大反應(yīng)速度的研究,我們發(fā)現(xiàn)野生型GLA的Km為2.39μmol/L, Vmax為0.0034μmol/min;突變型GLA的Km為1.27μmol/L, Vmax為0.0036μmol/min;標(biāo)準(zhǔn)品Km為3.45μmol/L, Vmax為0.0045μmol/min。提示突變型GLA對(duì)底物的親和力最高,標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)底物的親和力最低,但標(biāo)準(zhǔn)品比其他兩者的Vmax要略高,這也解釋了突變型GLA比野生型GLA的比活高的原因。 以上結(jié)果表明,我們通過(guò)定點(diǎn)突變的方法構(gòu)建了含突變型GLA基因的重組質(zhì)粒,并且轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞和HEK293細(xì)胞,獲得表達(dá)高活性GLA的單克隆細(xì)胞,其中轉(zhuǎn)染突變型GLA基因的CHO細(xì)胞[CHO(m-GLA)]的GLA表達(dá)水平最高。我們優(yōu)化了單克隆細(xì)胞誘導(dǎo)表達(dá)條件并進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)CHO(m-GLA)細(xì)胞培養(yǎng)上清的GLA比活性是CHO(GLA)細(xì)胞的10倍。收集并純化培養(yǎng)上清,SDS-PAGE和蛋白免疫印跡鑒定,證實(shí)通過(guò)一步親和層析即可獲得較高純度的GLA蛋白。對(duì)純化產(chǎn)品的活性及理化性質(zhì)分析結(jié)果顯示,突變型GLA蛋白的主要生化性質(zhì)沒(méi)有發(fā)生改變,但對(duì)底物的親和力及活性明顯提高,推斷突變不僅可以增加GLA mRNA的翻譯水平,而且可引起蛋白空間結(jié)構(gòu)的改變,從而提高GLA的活性�？傊�,我們獲得了高表達(dá)突變型GLA的CHO細(xì)胞株,并且重組GLA高純度、高活性,為下一步生產(chǎn)重組GLA并最終用于法布萊氏病的治療奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類(lèi)號(hào)】：R725.9
【圖文】：

進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，通過(guò) 1%瓊脂糖凝膠電泳分析，得到了預(yù)期大小為 1300kb左右的產(chǎn)物(圖 1-1)。圖1-1 人GLAcDNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物A.野生型GLA基因擴(kuò)增；B.突變型GLA基因擴(kuò)增；M. DNA標(biāo)志物 DL2000；1~2. PCR擴(kuò)增目的片段1.3.2 人 GLA 重組質(zhì)粒的構(gòu)建用 EcoRⅠ、XholⅠ分別對(duì)兩種 PCR 產(chǎn)物及 pcDNA3.1/myc-His A 質(zhì)粒進(jìn)行50003000200010007505002501005000300020001000750500250100A bp M 1 2 Bbp M 1 2

第一部分 重組質(zhì)粒的構(gòu)建收目的基因片段和表達(dá)載體基因，并用 T4 連接酶將其連接， 1-2)。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化 DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽(yáng)性菌落，搖經(jīng) EcoRⅠ、XholⅠ雙酶切，在重組質(zhì)粒上均可獲得 1300kb 左測(cè)序結(jié)果表明兩個(gè)重組質(zhì)粒分別含有野生型和突變型的 GLA-4)，分別命名為 pcDNA3.1/myc-His A-GLA 和 pcDNA3.1-GLA。

圖 1-4(A) 野生型 GLA 基因測(cè)序圖譜bpM 1 2 3圖1-3 重組質(zhì)粒的酶切鑒定M. DNA 標(biāo)志物 DL2000；1.pcDNA3.1/myc-His A-GLA質(zhì)粒酶切產(chǎn)物;2.pcDNA3.1/myc-His A-mutation-GLA質(zhì)粒酶切產(chǎn)物;3.空載體酶切產(chǎn)物.

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本文編號(hào)：2773458