Toll樣受體在新生兒感染時(shí)的變化及臨床意義

發(fā)布時(shí)間：2020-07-26 23:16

【摘要】： 目的新生兒免疫應(yīng)答反應(yīng)比較弱，易合并感染。Toll樣受體可誘導(dǎo)非特異性免疫應(yīng)答，介導(dǎo)特異性免疫反應(yīng)，在抗感染免疫中發(fā)揮重要作用。本文探討單個(gè)核細(xì)胞Toll樣受體2、3、4 mRNA、MD-2 mRNA和MyD88 mRNA，以及單核細(xì)胞／中性粒細(xì)胞表面TLR2、TLR4蛋白和陽性細(xì)胞百分比在新生兒感染時(shí)的變化，分析它們?cè)谛律鷥嚎垢腥久庖咧械淖饔煤团R床意義。同時(shí)觀察中性粒細(xì)胞表面CD64表達(dá)，對(duì)TLR與CD64進(jìn)行相關(guān)性分析，探討他們?cè)谠\斷新生兒感染中的作用。方法收集200例不同胎齡(26—43周)新生兒外周血，分為敗血癥組(21例)、細(xì)菌性肺炎組(70例)、細(xì)菌性腦膜炎組(17例)、尿路感染組(38例)、先天性梅毒組(11例)和非感染組(43例)。采用熒光定量PCR法測(cè)定TLR 2、3、4、MD-2和MyD88 mRNA水平，應(yīng)用流式細(xì)胞儀分析外周血單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞表面TLR2和TLR4蛋白及陽性細(xì)胞百分比水平。應(yīng)用流式細(xì)胞儀定量檢測(cè)其中120例感染和非感染新生兒外周血中性粒細(xì)胞表面CD64分子表達(dá)，并與CRP、WBC計(jì)數(shù)及血培養(yǎng)進(jìn)行比較，評(píng)價(jià)它們對(duì)診斷新生兒感染的臨床價(jià)值，同時(shí)對(duì)CD64與TLR做相關(guān)性分析。結(jié)果1．157例感染新生兒中，早產(chǎn)兒94例，足月兒63例。新生兒感染臨床癥狀不典型，主要表現(xiàn)為血氧飽和度下降、發(fā)熱或體溫不升、呼吸暫停、血小板減少、高膽紅素血癥、喂養(yǎng)不耐受(吃奶少或胃儲(chǔ)留)等。21例敗血癥患兒血培養(yǎng)全部陽性，主要為凝固酶陰性葡萄球菌；肺部感染70例，呼吸道分泌物培養(yǎng)陽性36例，主要為肺炎克雷伯菌；尿路感染38例，清潔中段尿培養(yǎng)陽性16例，主要為肺炎克雷伯菌：腦膜炎組17例，腦脊液培養(yǎng)陽性共2例，均為大腸桿菌。 2．在非感染組新生兒，TLR2、3、4在mRNA、蛋白表達(dá)和陽性細(xì)胞百分比水平與胎齡均無明顯相關(guān)性。 3．TLR2 mRNA在敗血癥組明顯增加(6.14±0.80)，在G~+菌敗血癥組表達(dá)最為顯著(6.43±0.74)，細(xì)菌性肺炎組(5.49±0.62)、細(xì)菌性腦膜炎組(5.61±0.60)和先天性梅毒組(5.89±0.38)也顯著增加。單核細(xì)胞表面TLR2蛋白表達(dá)在敗血癥組最高，為1.94±0.52，G~+菌敗血癥表達(dá)為2.54±0.68，G~-菌敗血癥表達(dá)為1.25±0.51，兩者比較P＜0.05，在細(xì)菌性肺炎組、細(xì)菌性腦膜炎組和先天梅毒組的表達(dá)均高于非感染組(1.27±0.75)。中性粒細(xì)胞表面TLR2蛋白表達(dá)在敗血癥組最高，為0.92±0.36，在G~+菌敗血癥為0.97±0.48，G~-菌敗血癥為0.80±0.31，兩者比較P＜0.05。感染組TLR2陽性細(xì)胞百分比與非感染組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 4．TLR3 mRNA在各感染組與非感染組之間比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 5．?dāng)⊙Y組TLR4 mRNA表達(dá)最高6.20±1.59，G~-菌敗血癥組為6.78±1.79，高于G~+菌敗血癥組5.39±0.78，(t=2.29，P=0.037)，在新生兒細(xì)菌性肺炎組、細(xì)菌性腦膜炎組和尿路感染組也明顯增高。單核細(xì)胞TLR4蛋白表達(dá)在各感染組與非感染組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，感染組TLR4陽性細(xì)胞百分比為(0.71±0.31)％，高于非感染組(0.29±0.36)％。中性粒細(xì)胞TLR4蛋白表達(dá)在敗血癥組最高，為3.25±1.25，在G~+菌敗血癥表達(dá)為2.97±1.48，G~-菌敗血癥為3.75±1.01，兩者比較P＜0.05，肺炎組、腦膜炎組和尿路感染組比非感染組明顯增高。感染組TLR4陽性細(xì)胞百分比與非感染組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 6．MD-2 mRNA在新生兒敗血癥組表達(dá)最高，G~+菌敗血癥組表達(dá)為5.43±1.19，G~-菌敗血癥組表達(dá)為5.76±1.17，兩者比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.594，P=0.56)，細(xì)菌性腦膜炎組、尿路感染組MD-2 mRNA顯著增高。MyD88 mRNA在新生兒敗血癥組表達(dá)最高5.71±0.94，MyD88 mRNA在G~+菌敗血癥組表達(dá)為5.92±1.01，在G~-菌敗血癥組表達(dá)為5.79±0.85，兩者比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.793，P=0.86)，MyD88 mRNA在新生兒各感染組均顯著增高。在敗血癥組，TLR2 mRNA與MD-2 mRNA相關(guān)系數(shù)為0.415，P=0.011；在肺炎組的相關(guān)系數(shù)為0.38，P=0.04。新生兒感染組TLR4 mRNA與MD-2 mRNA成正相關(guān)(R=0.39，P=0)，敗血癥組，TLR4 mRNA與MD-2mRNA相關(guān)系數(shù)為0.442，P=0.021：腦膜炎組TLR4 mRNA與MD-2 mRNA相關(guān)系數(shù)為0.913，P=0.004；尿路感染組相關(guān)系數(shù)為0.21，P=0.045。TLR2 mRNA與MyD88 mRNA相關(guān)性顯著(R=0.956，P=0.00)。TLR4 mRNA與MyD88 mRNA相關(guān)性顯著(R=0.997，P=0.00)。TLR3 mRNA與MD-2和MyD88 mRNA均無明顯相關(guān)性。 7．G~+菌敗血癥組TLR2 mRNA(6.43±0.74)表達(dá)顯著高于TLR4 mRNA(5.39±0.78)(t=1.56，P=0.024)，G~-菌敗血癥組TLR4 mRNA(6.78±0.79)表達(dá)顯著高于TLR2 mRNA(5.64±0.68) (t=2.63，P=0.011)。敗血癥組單核細(xì)胞TLR2蛋白表達(dá)顯著高于TLR4表達(dá)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.06，P=0.044)。TLR4陽性細(xì)胞百分比均顯著低于TLR2陽性細(xì)胞百分比，P＜0.01。各感染組中性粒細(xì)胞表面TLR4蛋白表達(dá)水平高于TLR2，P＜0.05；各感染組與非感染組之間比較，TLR4陽性細(xì)胞百分比均顯著低于TLR2陽性細(xì)胞百分比，P＜0.01。 8．?dāng)⊙Y組CD64表達(dá)為7845.25±1790.07 M／U，顯著高于局部感染組4003.86±1790.07 M／U(P=0.00)；通過繪制ROC曲線確定CD64陽性標(biāo)準(zhǔn)為≥3000 M／U。新生兒敗血癥組，CD64檢測(cè)陽性率為91％，靈敏度為92％，明顯高于血培養(yǎng)及CRP。敗血癥組和其他感染組TLR2和TLR4蛋白表達(dá)與CD64相關(guān)性分析，在敗血癥組TLR2和TLR4與CD64有顯著相關(guān)性，通過TLR2和TLR4可區(qū)分G~+和G~-菌感染，但CD64不能。結(jié)論新生兒感染時(shí)不同免疫細(xì)胞TLR2 mRNA／蛋白和TLR4 mRNA／蛋白表達(dá)顯著增高，特別是在嚴(yán)重感染敗血癥組。TLR2主要在G~+菌感染增高，TLR4主要在G~-菌感染增高。TLR2和4表達(dá)與MD-2和MyD88有相關(guān)性，提示TLR2和TLR4及信號(hào)傳導(dǎo)途徑均參與新生兒抗感染免疫機(jī)制。新生兒感染時(shí)中性粒細(xì)胞CD64表達(dá)明顯增高，可望成為診斷新生感染的指標(biāo)，中性粒細(xì)胞表面TLR與CD64有顯著相關(guān)性。這些結(jié)果為進(jìn)一步深入了解新生兒抗感染免疫機(jī)制提供新思路和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2006
【分類號(hào)】：R722.1
【圖文】：

白膜,溶液,稀釋倍數(shù),真空

注意不要弄斷)，2一8℃下7500轉(zhuǎn)下一點(diǎn)先在小機(jī)器上甩一下，用10ul到那層白膜，如開始白膜就看不見或者A:在空氣或真空中放置5一10分鐘，5ulDEPC水，配成溶液A。通過測(cè)量數(shù)計(jì)算50倍。取出4u1A溶液+196u1D稀釋倍數(shù)/1000)XB(多少溶液ml)=14ul溶液。在紫外分光光度儀上分別白的波長(zhǎng)為280。A跑電泳，了解RNA的純度:在l%瓊15一20分鐘，80一100MV，見圖1。

溶解曲線,電泳帶,反應(yīng)體系,PCR擴(kuò)增