【摘要】： 研究背景 急性呼吸道感染(Acute respiratory tract infection,ARTI)是兒科臨床中最為常見的疾病,也是5歲以下兒童死亡的重要原因。呼吸道感染的病原十分復(fù)雜,病毒在其中占有很大的比重,如呼吸道合胞病毒(RSV)、人偏肺病毒(hMPV)、流感病毒(A,B型)、副流感病毒(1,2,3型)和腺病毒(AdV)等。但迄今為止仍有相當(dāng)部分兒童急性呼吸道感染的病原未能闡明,使針對性預(yù)防和治療力度大大減低,且可能間接造成抗生素濫用。因此,逐步闡明兒童呼吸道感染中這部分未知病毒病原的構(gòu)成、發(fā)病率及特征具有十分重要的實(shí)踐意義。 2005年8月22日,瑞典學(xué)者Tobias Allander采用隨機(jī)PCR擴(kuò)增,測序并結(jié)合生物信息學(xué)方法對兒童急性呼吸道感染樣本進(jìn)行大規(guī)模篩查,發(fā)現(xiàn)一種新的細(xì)小病毒,命名為人博卡病毒(Human Bocavirus,HBoV)。它與牛細(xì)小病毒(Bovine parvovirus,BPV)和豬細(xì)小病毒(Minute virus of Canine,MVC)同屬細(xì)小病毒亞科中的博卡病毒屬。此后,澳大利亞、日本、加拿大、法國、德國、韓國、美國等國家相繼檢測到該病毒,提示其全球流行。從目前研究資料看,HBoV感染的發(fā)病率為1.5%-18.3%,在不同年齡組人群中都可致急性呼吸道感染,但5歲以下兒童感染率較高,尤以6個(gè)月至2歲常見。有關(guān)HBoV的血清流行病學(xué)、免疫發(fā)病機(jī)制及防治手段的研究則尚未見報(bào)道。在國內(nèi),中國疾病預(yù)防控制中心對湖南郴州市兒童呼吸道博卡病毒感染進(jìn)行了報(bào)道。浙江省亦在急性下呼吸道感染患兒的鼻咽吸取物中檢測到HBoV,還建立了博卡病毒的熒光定量PCR檢測方法。廣州地區(qū)利用原核表達(dá)的HBoV VP1蛋白,進(jìn)行了血清流行病學(xué)調(diào)查,陽性率為7.06%。但以上課題組的研究,多是在冬季收集標(biāo)本,標(biāo)本量亦較小。 目的 分析HBoV感染的發(fā)病、分布季節(jié)、年齡、臨床表現(xiàn)等情況,證實(shí)其亦為重慶地區(qū)兒童急性呼吸道感染的病原之一并初步闡明其分子流行病學(xué)規(guī)律,為進(jìn)一步的防治研究提供理論依據(jù)。 方法 1.標(biāo)本收集: 2006年4月-2007年3月,在重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院呼吸內(nèi)科病房收集因呼吸道感染住院患兒的鼻咽吸取物標(biāo)本。 2.直接免疫熒光法(DFA)檢測標(biāo)本中的常見呼吸道病毒感染情況:標(biāo)本處理后,細(xì)胞沉渣用于直接免疫熒光法檢測呼吸道合胞病毒、流感病毒A、B亞型、副流感病毒1、2、3型及腺病毒。 3.用PCR方法檢測標(biāo)本中HBoV:標(biāo)本收集后,取200μl用QIAamp (?) DNA Mini Kit (QIAGEN Inc,USA)提取病毒基因組DNA,提取的DNA用于HBoV的NS1基因及NP-1基因核酸片斷的擴(kuò)增。 4.流行病學(xué)分析:分析HBoV檢出陽性率、HBoV感染的季節(jié)分布、年齡分布特點(diǎn)等; HBoV與其它呼吸道病毒病原協(xié)同感染情況等。 5.HBoV陽性標(biāo)本患兒臨床資料分析:患兒的入院診斷、主要癥狀、實(shí)驗(yàn)室檢查、X線表現(xiàn)特點(diǎn)等。 6.序列測定及比對分析:將陽性PCR產(chǎn)物進(jìn)行序列分析,與GeneBank中的HBoV ST1和HBoV ST2序列比對;并運(yùn)用ClustalX及DNAStar軟件對其遺傳進(jìn)化發(fā)生和核酸、氨基酸的同源性進(jìn)行分析。 結(jié)果 1.在2006年至2007年一年期間,共收集呼吸道感染住院患兒鼻咽吸取物標(biāo)本395份。 2.PCR檢測:395份鼻咽吸取物中共檢測到21份陽性擴(kuò)增產(chǎn)物,陽性率為5.3%(21/395)。NP-1基因產(chǎn)物約為354bp,NS1基因產(chǎn)物約為291bp。將兩個(gè)基因片斷均成功擴(kuò)出的標(biāo)本作為陽性標(biāo)本。 3.在21份鼻咽分泌物HBoV PCR陽性的患兒中,男性16例,女性5例;年齡分布較集中,2歲以下20例,占陽性病例總數(shù)的95.2%;小于1歲者13例,占61.9%,僅有1例患兒的年齡大于2歲。發(fā)病季節(jié)以冬季(12月、1月、2月)為主,檢出9例;其次是夏季,春秋兩季較少見。臨床表現(xiàn)主要為咳嗽、吼喘、氣促、紫紺以及肺部濕羅音和哮鳴音。臨床診斷以下呼吸道感染為主,分別為:8例診斷為間質(zhì)性肺炎,4例支氣管肺炎,4例毛細(xì)支氣管炎,2例支氣管炎,2例遷延性肺炎、1例右肺肺炎。21名HBoV陽性患兒的病程大都偏長,12例病程超過10天,其中有5例超過1個(gè)月。21例HBoV PCR陽性患兒中13例出現(xiàn)吼喘,提示HBoV可能是導(dǎo)致兒童喘息的病原之一。3例(14.3%)伴有呼吸道合胞病毒(RSV)感染。 4.PCR擴(kuò)增產(chǎn)物序列測定和比較分析:選取10份NP-1基因PCR產(chǎn)物進(jìn)行核苷酸序列測定,并在GeneBank中進(jìn)行比對。應(yīng)用ClustalX軟件對序列進(jìn)行遺傳發(fā)生進(jìn)化分析顯示:10份擴(kuò)增產(chǎn)物序列在進(jìn)化上距HBoV ST1較近,而與HBoV ST2距離較遠(yuǎn)。利用DNAStar軟件對21份產(chǎn)物及HBoV ST1、ST2的核苷酸序列進(jìn)行了變異分析,比較結(jié)果顯示:在核苷酸水平上,21份產(chǎn)物與HBoV ST1、ST2的核苷酸同源性分別為99.0%～100%、98.7%～100%,21份產(chǎn)物擴(kuò)增片斷之間的同源性為98.5%-100%,顯示高度的同源性。在氨基酸水平上,21份擴(kuò)增產(chǎn)物與HBoV ST1、ST2的同源性為99.0～100%。 結(jié)論 通過PCR檢測,證實(shí)HBoV是重慶地區(qū)兒童呼吸道感染的病毒病原之一。HBoV感染主要以2歲以下兒童為主,季節(jié)以冬季較多見,HBoV感染的臨床表現(xiàn)與呼吸道合胞病毒感染相似,并可能與喘息性疾病及重癥呼吸道疾病有關(guān)。重慶地區(qū)兒童呼吸道博卡病毒感染以HBoV ST1為主,且序列變異度小。呼吸道合胞病毒可能與HBoV協(xié)同感染患兒。
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號】：R725.6
【圖文】：

實(shí)驗(yàn)結(jié)果.標(biāo)本收集情況2006 年 4 月 1 日至 2007 年 3 月 31 日，一年期間收集呼吸道感染住院患兒咽吸取物標(biāo)本共 395 例。其中男性 248 例，女性 147 例；年齡 0～3 月 90 例～6 月 86 例，6 月～2 歲 140 例，2～5 歲 61 例，5 歲以上 18 例。.標(biāo)本收集及 DFA 檢測通過直接免疫熒光實(shí)驗(yàn)篩查呼吸道合胞病毒、流感病毒 A、B 亞型、副流感 1、2、3 型及腺病毒等常見呼吸道病毒病原。陽性標(biāo)本顯示 2 個(gè)以上綠色熒胞，胞漿呈現(xiàn)明亮的綠色熒光、胞核無熒光；陰性標(biāo)本呈紅色細(xì)胞（圖 1-1）

PCR 檢測鼻咽吸取物標(biāo)本中提取的總 DNA，用于擴(kuò)增 HBoV 的因片斷，同時(shí)設(shè)立陽性對照和陰性對照（陽性對照為測序?qū)φ諡槌兯�。將兩個(gè)基因片斷均成功擴(kuò)出的標(biāo)本作膠電泳后顯示目的條帶，NP-1 基因產(chǎn)物約 354bp，NS對照無條帶（圖 1-2，圖 1-3）。初步證實(shí) HBoV 為重慶之一。

圖 1-3、部分標(biāo)本 HBoV NS1 基因 PCR 擴(kuò)增結(jié)果Fig. 1-3. PCR results against HBoV NS1 generker; 2~6: 291bp amplified products for NS1 gene ofle,No.115 sample,No.265 sample,No.329 sample,No.38rol for NS1 gene ; 8: Negative control for NS1 gene, nofied byHBoV NP-1 and NS1 gene PCR results, HBoV isn responsible for respiratory infection in Chongqing.染的流行病學(xué)分析 感染的陽性率 年 4 月至 2007 年 3 月間，共收集因呼吸道感染住院患，年齡為 20 天～10 歲（年齡分布見表 1-1）。通過 PCP-1 和 NS1 基因片斷，共檢出 21 例陽性標(biāo)本，陽性率

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 林峰;曾愛平;楊寧敏;林海燕;鄭昌華;李樺;陳弘;李旭陽;郁明素;楊寶順;金大智;;小兒人博卡病毒感染臨床與實(shí)驗(yàn)研究[J];醫(yī)學(xué)研究雜志;2006年09期

本文編號：2769143