【摘要】： 研究背景 急性呼吸道感染(Acute respiratory tract infection,ARTI)是兒科臨床中最為常見的疾病,也是5歲以下兒童死亡的重要原因。呼吸道感染的病原十分復雜,病毒在其中占有很大的比重,如呼吸道合胞病毒(RSV)、人偏肺病毒(hMPV)、流感病毒(A,B型)、副流感病毒(1,2,3型)和腺病毒(AdV)等。但迄今為止仍有相當部分兒童急性呼吸道感染的病原未能闡明,使針對性預防和治療力度大大減低,且可能間接造成抗生素濫用。因此,逐步闡明兒童呼吸道感染中這部分未知病毒病原的構(gòu)成、發(fā)病率及特征具有十分重要的實踐意義。 2005年8月22日,瑞典學者Tobias Allander采用隨機PCR擴增,測序并結(jié)合生物信息學方法對兒童急性呼吸道感染樣本進行大規(guī)模篩查,發(fā)現(xiàn)一種新的細小病毒,命名為人博卡病毒(Human Bocavirus,HBoV)。它與牛細小病毒(Bovine parvovirus,BPV)和豬細小病毒(Minute virus of Canine,MVC)同屬細小病毒亞科中的博卡病毒屬。此后,澳大利亞、日本、加拿大、法國、德國、韓國、美國等國家相繼檢測到該病毒,提示其全球流行。從目前研究資料看,HBoV感染的發(fā)病率為1.5%-18.3%,在不同年齡組人群中都可致急性呼吸道感染,但5歲以下兒童感染率較高,尤以6個月至2歲常見。有關(guān)HBoV的血清流行病學、免疫發(fā)病機制及防治手段的研究則尚未見報道。在國內(nèi),中國疾病預防控制中心對湖南郴州市兒童呼吸道博卡病毒感染進行了報道。浙江省亦在急性下呼吸道感染患兒的鼻咽吸取物中檢測到HBoV,還建立了博卡病毒的熒光定量PCR檢測方法。廣州地區(qū)利用原核表達的HBoV VP1蛋白,進行了血清流行病學調(diào)查,陽性率為7.06%。但以上課題組的研究,多是在冬季收集標本,標本量亦較小。 目的 分析HBoV感染的發(fā)病、分布季節(jié)、年齡、臨床表現(xiàn)等情況,證實其亦為重慶地區(qū)兒童急性呼吸道感染的病原之一并初步闡明其分子流行病學規(guī)律,為進一步的防治研究提供理論依據(jù)。 方法 1.標本收集: 2006年4月-2007年3月,在重慶醫(yī)科大學附屬兒童醫(yī)院呼吸內(nèi)科病房收集因呼吸道感染住院患兒的鼻咽吸取物標本。 2.直接免疫熒光法(DFA)檢測標本中的常見呼吸道病毒感染情況:標本處理后,細胞沉渣用于直接免疫熒光法檢測呼吸道合胞病毒、流感病毒A、B亞型、副流感病毒1、2、3型及腺病毒。 3.用PCR方法檢測標本中HBoV:標本收集后,取200μl用QIAamp (?) DNA Mini Kit (QIAGEN Inc,USA)提取病毒基因組DNA,提取的DNA用于HBoV的NS1基因及NP-1基因核酸片斷的擴增。 4.流行病學分析:分析HBoV檢出陽性率、HBoV感染的季節(jié)分布、年齡分布特點等; HBoV與其它呼吸道病毒病原協(xié)同感染情況等。 5.HBoV陽性標本患兒臨床資料分析:患兒的入院診斷、主要癥狀、實驗室檢查、X線表現(xiàn)特點等。 6.序列測定及比對分析:將陽性PCR產(chǎn)物進行序列分析,與GeneBank中的HBoV ST1和HBoV ST2序列比對;并運用ClustalX及DNAStar軟件對其遺傳進化發(fā)生和核酸、氨基酸的同源性進行分析。 結(jié)果 1.在2006年至2007年一年期間,共收集呼吸道感染住院患兒鼻咽吸取物標本395份。 2.PCR檢測:395份鼻咽吸取物中共檢測到21份陽性擴增產(chǎn)物,陽性率為5.3%(21/395)。NP-1基因產(chǎn)物約為354bp,NS1基因產(chǎn)物約為291bp。將兩個基因片斷均成功擴出的標本作為陽性標本。 3.在21份鼻咽分泌物HBoV PCR陽性的患兒中,男性16例,女性5例;年齡分布較集中,2歲以下20例,占陽性病例總數(shù)的95.2%;小于1歲者13例,占61.9%,僅有1例患兒的年齡大于2歲。發(fā)病季節(jié)以冬季(12月、1月、2月)為主,檢出9例;其次是夏季,春秋兩季較少見。臨床表現(xiàn)主要為咳嗽、吼喘、氣促、紫紺以及肺部濕羅音和哮鳴音。臨床診斷以下呼吸道感染為主,分別為:8例診斷為間質(zhì)性肺炎,4例支氣管肺炎,4例毛細支氣管炎,2例支氣管炎,2例遷延性肺炎、1例右肺肺炎。21名HBoV陽性患兒的病程大都偏長,12例病程超過10天,其中有5例超過1個月。21例HBoV PCR陽性患兒中13例出現(xiàn)吼喘,提示HBoV可能是導致兒童喘息的病原之一。3例(14.3%)伴有呼吸道合胞病毒(RSV)感染。 4.PCR擴增產(chǎn)物序列測定和比較分析:選取10份NP-1基因PCR產(chǎn)物進行核苷酸序列測定,并在GeneBank中進行比對。應用ClustalX軟件對序列進行遺傳發(fā)生進化分析顯示:10份擴增產(chǎn)物序列在進化上距HBoV ST1較近,而與HBoV ST2距離較遠。利用DNAStar軟件對21份產(chǎn)物及HBoV ST1、ST2的核苷酸序列進行了變異分析,比較結(jié)果顯示:在核苷酸水平上,21份產(chǎn)物與HBoV ST1、ST2的核苷酸同源性分別為99.0%～100%、98.7%～100%,21份產(chǎn)物擴增片斷之間的同源性為98.5%-100%,顯示高度的同源性。在氨基酸水平上,21份擴增產(chǎn)物與HBoV ST1、ST2的同源性為99.0～100%。 結(jié)論 通過PCR檢測,證實HBoV是重慶地區(qū)兒童呼吸道感染的病毒病原之一。HBoV感染主要以2歲以下兒童為主,季節(jié)以冬季較多見,HBoV感染的臨床表現(xiàn)與呼吸道合胞病毒感染相似,并可能與喘息性疾病及重癥呼吸道疾病有關(guān)。重慶地區(qū)兒童呼吸道博卡病毒感染以HBoV ST1為主,且序列變異度小。呼吸道合胞病毒可能與HBoV協(xié)同感染患兒。
【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2007
【分類號】：R725.6
【圖文】：

實驗結(jié)果.標本收集情況2006 年 4 月 1 日至 2007 年 3 月 31 日，一年期間收集呼吸道感染住院患兒咽吸取物標本共 395 例。其中男性 248 例，女性 147 例；年齡 0～3 月 90 例～6 月 86 例，6 月～2 歲 140 例，2～5 歲 61 例，5 歲以上 18 例。.標本收集及 DFA 檢測通過直接免疫熒光實驗篩查呼吸道合胞病毒、流感病毒 A、B 亞型、副流感 1、2、3 型及腺病毒等常見呼吸道病毒病原。陽性標本顯示 2 個以上綠色熒胞，胞漿呈現(xiàn)明亮的綠色熒光、胞核無熒光；陰性標本呈紅色細胞（圖 1-1）

PCR 檢測鼻咽吸取物標本中提取的總 DNA，用于擴增 HBoV 的因片斷，同時設(shè)立陽性對照和陰性對照（陽性對照為測序?qū)φ諡槌兯�。將兩個基因片斷均成功擴出的標本作膠電泳后顯示目的條帶，NP-1 基因產(chǎn)物約 354bp，NS對照無條帶（圖 1-2，圖 1-3）。初步證實 HBoV 為重慶之一。

圖 1-3、部分標本 HBoV NS1 基因 PCR 擴增結(jié)果Fig. 1-3. PCR results against HBoV NS1 generker; 2~6: 291bp amplified products for NS1 gene ofle,No.115 sample,No.265 sample,No.329 sample,No.38rol for NS1 gene ; 8: Negative control for NS1 gene, nofied byHBoV NP-1 and NS1 gene PCR results, HBoV isn responsible for respiratory infection in Chongqing.染的流行病學分析 感染的陽性率 年 4 月至 2007 年 3 月間，共收集因呼吸道感染住院患，年齡為 20 天～10 歲（年齡分布見表 1-1）。通過 PCP-1 和 NS1 基因片斷，共檢出 21 例陽性標本，陽性率

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 林峰;曾愛平;楊寧敏;林海燕;鄭昌華;李樺;陳弘;李旭陽;郁明素;楊寶順;金大智;;小兒人博卡病毒感染臨床與實驗研究[J];醫(yī)學研究雜志;2006年09期

本文編號：2769143