發(fā)布時(shí)間：2020-07-20 07:39

【摘要】：第一部分不同劑量維生素A補(bǔ)充對(duì)VAD的ASD兒童維生素A營養(yǎng)、OXT水平及核心癥狀的作用目的:孤獨(dú)癥譜系障礙(autism spectrum disorders,ASD)是一組神經(jīng)發(fā)育障礙疾病,以重復(fù)刻板行為和社交功能受損為兩大核心癥狀,是目前全球患病人數(shù)增長最快的嚴(yán)重疾病之一。ASD兒童常伴發(fā)各種共患病,影響康復(fù)及生活質(zhì)量,其中營養(yǎng)素缺乏是兒童ASD較常見的共患疾病,營養(yǎng)補(bǔ)充治療已被用于糾正ASD患者的營養(yǎng)素缺乏,并有研究發(fā)現(xiàn)通過某些營養(yǎng)素補(bǔ)充(葉酸、維生素B、維生素D等)可能改善ASD核心癥狀。維生素A(vitamin A,VA)補(bǔ)充對(duì)ASD癥狀改善作用尚不明確,已有研究報(bào)道ASD兒童維生素A缺乏率高發(fā),采用世界衛(wèi)生組織(world health organization,WHO)推薦劑量補(bǔ)充VA(vitamin A supplement,VAS)可一定程度改善ASD兒童VA水平,而對(duì)ASD癥狀未見明顯改善作用。本研究首次對(duì)ASD兒童采用持續(xù)低劑量VA補(bǔ)充方法,并與WHO推薦的一次性高劑量VA補(bǔ)充方案對(duì)比,探討不同維生素A補(bǔ)充劑量對(duì)ASD兒童的維生素A營養(yǎng)改善效果,探索適宜ASD兒童的VA補(bǔ)充方案。此外,通過分析ASD兒童VAS前后ASD癥狀量表、ASD相關(guān)分子CD38、催產(chǎn)素(oxytocin,OXT)變化情況及相關(guān)性分析,進(jìn)一步探討VAS是否可能是改善ASD兒童核心癥狀的治療方法之一。方法:(1)納入對(duì)象:通過整群抽樣方法納入康復(fù)機(jī)構(gòu)在訓(xùn)的138名ASD兒童(118名男性,20名女性),年齡3-8歲,所有ASD兒童均根據(jù)精神障礙診斷和統(tǒng)計(jì)手冊(cè)(diagnostic and statistical manual of mental disorder,DSM-V)診斷標(biāo)準(zhǔn)由專業(yè)發(fā)育行為兒科醫(yī)師確診。(2)基線調(diào)查:包括所有兒童體格測量及體格發(fā)育Z評(píng)分轉(zhuǎn)換,完成社交反應(yīng)量表(social responsiveness scale,SRS)、孤獨(dú)癥行為量表(Autism behavior checklist,ABC)、兒童孤獨(dú)癥評(píng)估量表(Childhood autism rating scale,CARS)以綜合評(píng)估入組ASD兒童孤獨(dú)癥癥狀及嚴(yán)重程度。(3)血液生化指標(biāo)測量:采取外周靜脈血2mL,分離血清及血細(xì)胞,采用高效液相色譜法(high performance liquid chromatography,HPLC)檢測血清視黃醇濃度(VA)、酶聯(lián)免疫吸附法(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay,ELISA)檢測血清OXT濃度;提取外周血單核細(xì)胞(PBMC)中總RNA,逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)檢測視黃酸受體(RARs,包括RARα、RARβ、RARγ三個(gè)亞型受體)及CD38基因的相對(duì)mRNA表達(dá)量。(4)維生素A補(bǔ)充:入組兒童根據(jù)VA水平分為維生素A水平正常(vitamin A normal,VAN,血清VA大于等于1.05μmol/L)、維生素A不足組(vitamin A deficiency,VAD,血清VA小于1.05μmol/L),采用隨機(jī)分組將VAD兒童分為VAD-1、VAD-2組,接受不同劑量的維生素A補(bǔ)充(vitamin A supplement,VAS)。共56名VAN的ASD兒童接受康復(fù)機(jī)構(gòu)行為治療。46名VAD-1組ASD兒童在行為治療基礎(chǔ)上一次性口服20萬單位維生素A補(bǔ)充劑治療(VAD-VAS1)。36名VAD-2組ASD兒童使用持續(xù)低劑量維生素A(平均3022單位/天)補(bǔ)充方案(VAD-VAS2)口服補(bǔ)充6個(gè)月。6個(gè)月后重新評(píng)估138名ASD患者體格發(fā)育指標(biāo)、ASD癥狀評(píng)定量表,血清VA、OXT濃度,以及RARs,CD38 mRNA表達(dá)水平。(5)統(tǒng)計(jì)分析:采用配對(duì)t檢驗(yàn)對(duì)各組兒童干預(yù)前后相關(guān)指標(biāo)變化進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,并將所有入組兒童干預(yù)前后VA變化水平與其他檢測指標(biāo)變化水平進(jìn)行Pearson相關(guān)分析。結(jié)果:(1)兩種VAS方案均可顯著改善VAD的ASD兒童血清VA水平(VAS1:P=0.0061;VAS2:P0.0001)。采用VAD-VAS1治療的兒童血清VA濃度恢復(fù)至正常水平(1.05μmol/L以上)的比例為21/46(45.7%)。VAD-VAS2治療的兒童血清VA恢復(fù)至正常水平的比例為23/36(63.9%),兩種VAS方案恢復(fù)比例沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(χ~2=2.701,P=0.100)。(2)VAD-VAS2方案可顯著增加ASD兒童血清OXT(P=0.0027)水平,降低SRS(P=0.0162)總得分,以及PBMC中RARβ(P=0.0295)、CD38(P=0.0272)mRNA表達(dá)水平。VAD-VAS1方案對(duì)血清OXT水平、SRS得分及PBMC相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平無顯著改變。兩種補(bǔ)充方案對(duì)ABC、CARS量表分均無顯著作用。(3)VA變化水平與OXT變化程度(P0.0001,r=0.3735)呈顯著正相關(guān)。VA變化程度與SRS量表評(píng)分變化程度呈負(fù)相關(guān)(P=0.0026,r=-0.2615)。而VA變化水平與CARS、ABC量表評(píng)分變化之間未觀察到顯著相關(guān)性。結(jié)論:兩種VAS方案均可顯著改善伴有VAD的ASD兒童VA水平,此外,持續(xù)低劑量VAS可增強(qiáng)RARβ、CD38 mRNA表達(dá)水平。持續(xù)低劑量VAS可改善ASD兒童CD38、OXT水平和社交功能,有望成為改善ASD兒童VA水平及核心癥狀的治療方法,但需要更多大樣本隨機(jī)對(duì)照臨床研究證實(shí)。VAS可能通過RARβ增加下游CD38、OXT水平從而改善ASD社交功能,具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。第二部分大鼠下丘腦RARβ信號(hào)改變對(duì)CD38、OXT調(diào)控作用以及對(duì)獨(dú)癥樣行為的影響及機(jī)制研究目的:本研究第一部分發(fā)現(xiàn)持續(xù)低劑量補(bǔ)充VA可同時(shí)改善ASD兒童的VA水平及社交功能,并檢測到血清OXT水平增高,外周血RARβ及CD38基因m RNA表達(dá)顯著上升,提示RARβ可能通過調(diào)節(jié)CD38、OXT水平,發(fā)揮VAS對(duì)ASD社交功能改善作用的關(guān)鍵因子。RA-RARs信號(hào)通路在腦發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用,RA信號(hào)通路異�？赡芘cASD發(fā)病相關(guān),前期研究發(fā)現(xiàn)RARβ可能是大鼠CD38、OXT基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子。而RARβ在下丘腦(OXT生成的腦區(qū))的功能尚不能明確,RA-RARβ信號(hào)通路對(duì)CD38及OXT基因的具體調(diào)節(jié)機(jī)制有待進(jìn)一步明確。因此,為探索RARβ對(duì)CD38、OXT的調(diào)控作用及對(duì)ASD癥狀的影響,本部分研究通過定位改變大鼠下丘腦RARβ表達(dá)信號(hào),檢測不同RARβ信號(hào)對(duì)ASD相關(guān)分子(CD38、OXT)及大鼠孤獨(dú)癥樣行為的影響,進(jìn)一步通過體外試驗(yàn)驗(yàn)證RARβ作為轉(zhuǎn)錄因子對(duì)CD38基因及OXT基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制。方法:(1)體內(nèi)研究:選取2周齡SD大鼠,采用大鼠腦立體定位注射系統(tǒng)將包含干擾RARβ或過表達(dá)RARβ載體的腺相關(guān)病毒(adenoassociated virus,AAV)注射至大鼠下丘腦,同一窩出生幼鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組(Control)、PBS注射組(PBS)、過表達(dá)AAV空載病毒組(CON-RARβ)、過表達(dá)RARβ-AAV注射組(AAV-RARβ)、干擾AAV空載病毒組(CON-si-RARβ)、干擾RARβ-AAV注射組(si-RARβ)共計(jì)6組進(jìn)行對(duì)應(yīng)溶劑或病毒注射,持續(xù)干擾大鼠體內(nèi)下丘腦RARβ信號(hào)。將處理后的大鼠飼養(yǎng)至8周齡,采用ANYmaze動(dòng)物行為學(xué)視頻分析系統(tǒng),包括嗅覺測試,三廂社交測試和曠場測試,評(píng)估各組大鼠的孤獨(dú)癥樣行為。完成行為學(xué)測試后,收集大鼠血液、腦組織標(biāo)本。HPLC方法檢測大鼠血清VA濃度、ELISA方法檢測OXT濃度,Western Blot方法檢測大鼠下丘腦RARβ、CD38蛋白表達(dá)。(2)體外研究:選取胎齡17-18天胎鼠,提取胎鼠下丘腦組織中原代神經(jīng)元進(jìn)行體外培養(yǎng),培養(yǎng)至第5天采用1μmol/L全反式視黃酸(at RA)干預(yù),24小時(shí)后提取神經(jīng)元細(xì)胞蛋白及總RNA進(jìn)行后續(xù)檢測。Western Blot方法檢測下丘腦原代神經(jīng)元RARs(RARα、RARβ、RARγ)及CD38蛋白表達(dá)量,RT-PCR方法檢測下丘腦神經(jīng)元RARs(RARα、RARβ、RARγ)及CD38、OXT、OXTR m RNA表達(dá)情況,染色質(zhì)免疫共沉淀方法(chromatinimmunoprecipitation,Ch IP-q PCR)及雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(dualluciferase reporter assay)驗(yàn)證RARβ轉(zhuǎn)錄因子對(duì)CD38、OXT基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性及結(jié)合區(qū)域。結(jié)果:(1)定位注射RARβ干擾病毒大鼠下丘腦RARβ(P=0.0091)、CD38(P0.0001)蛋白表達(dá)水平及血清OXT(P=0.0004)水平顯著低于對(duì)照組;注射過表達(dá)RARβ病毒對(duì)下丘腦RARβ、CD38蛋白表達(dá)及血清OXT水平無顯著改變,下丘腦RARβ信號(hào)降低或增加后對(duì)大鼠血清VA水平無顯著影響。(2)注射si-RARβ大鼠嗅社交類氣體次數(shù)顯著降低(P=0.0463);三廂測試中與陌生鼠的互動(dòng)時(shí)間少于對(duì)照組(P=0.1892),與玩具的互動(dòng)時(shí)間長于對(duì)照組(P=0.1304),但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;曠場測試中梳毛時(shí)長(P=0.0031)及梳毛次數(shù)(P=0.0057)顯著增加。過表達(dá)RARβ大鼠三廂社交測試中與陌生大鼠互動(dòng)時(shí)長增加(P=0.0445),嗅覺測試、曠場測試行為學(xué)指標(biāo)無顯著變化。(3)at RA處理后下丘腦神經(jīng)元RARβ(P=0.0049)、CD38(P=0.0003)、及OXT(P=0.0266)m RNA和蛋白表達(dá)水平顯著增加,RARβ與CD38基因啟動(dòng)子區(qū)2號(hào)預(yù)測位點(diǎn)結(jié)合增強(qiáng)(P=0.0167)、與OXT基因1號(hào)預(yù)測位點(diǎn)結(jié)合增強(qiáng)(P=0.05)。雙熒光素酶報(bào)告基因檢測顯示RARβ對(duì)CD38、OXT基因都具有轉(zhuǎn)錄活性。電鏡檢測可見經(jīng)at RA干預(yù)的神經(jīng)元突出囊泡分泌較對(duì)照組增多。結(jié)論:(1)下丘腦定位注射si-RARβ腺相關(guān)病毒可降低RARβ蛋白、CD38蛋白表達(dá)水平及血清OXT水平;過表達(dá)RARβ信號(hào)對(duì)CD38蛋白及血清OXT水平無明顯影響,下丘腦RARβ信號(hào)降低或增加后對(duì)大鼠血清VA水平無顯著影響。(2)注射si-RARβ大鼠可能有社交功能受損的癥狀,主要體現(xiàn)在對(duì)社交類氣體的嗅覺探索功能受損,并伴有重復(fù)刻板行為。過表達(dá)AAV-RARβ的大鼠與陌生同類大鼠互動(dòng)時(shí)間增加,其余行為學(xué)未觀察到明顯改變。(3)at RA可顯著增加下丘腦神經(jīng)元RARβ、CD38、OXT基因m RNA和蛋白表達(dá)水平,RARβ對(duì)CD38、OXT基因都具有轉(zhuǎn)錄活性,RARβ對(duì)OXT的轉(zhuǎn)錄調(diào)控可能增加OXT蛋白合成、RARβ對(duì)CD38的轉(zhuǎn)錄調(diào)控可能間接促進(jìn)OXT釋放,使OXT合成、釋放體系得到雙重改善。
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R749.94
【圖文】：

圖 1 CD38-OXT-OXTR 系統(tǒng)作用關(guān)系圖[24]Figure 1 Relationships among CD38-OXT-OXTR system.然而，關(guān)于 OXT 治療兒童 ASD 的研究較少[25]，有個(gè)別綜述報(bào)道兒童和青少 ASD 每日靜脈注射 0.4 IU/kg 劑量的催產(chǎn)素是安全且有效的，但是關(guān)于 OXT 對(duì)童ASD治療的安全性和有效性研究尚處于初步階段，需要大規(guī)模的研究明確[26]。此，目前尚沒有充分的循證醫(yī)學(xué)證據(jù)支持 OXT 治療兒童 ASD，尋到 OXT 的替方案可能有助于兒童 ASD 社交功能的改善。RA 信號(hào)通路可能通過 RARs 對(duì) CD38-OXT 發(fā)揮作用，并參與到 ASD 的病理制中。ASD 患者的永生化淋巴細(xì)胞中 CD38 mRNA 表達(dá)顯著降低[27]，通過全反視黃酸（atRA）干預(yù)可上調(diào) ASD 患者永生化淋巴細(xì)胞中 CD38 mRNA 轉(zhuǎn)錄[28]。外，ASD 患者的紅細(xì)胞 RALDH1 水平顯著降低[29]，RALDH1 在中腦多巴胺能統(tǒng)中影響動(dòng)機(jī)、認(rèn)知和社會(huì)行為。大鼠孕期 VAD 可能是子代發(fā)生孤獨(dú)癥樣行為

重慶醫(yī)科大學(xué)博士研究生學(xué)位論文酶 1 家族）拮抗劑誘導(dǎo)出小鼠出現(xiàn)孤獨(dú)癥樣癥狀，而視黃酸（Retinoicacid,RA）充可顯著減輕過量 UBE3A 誘導(dǎo)出的 ASD 樣表型[31]。本研究前期通過轉(zhuǎn)錄因子據(jù)庫（Genomatix）也預(yù)測到了 RARs 對(duì) CD38、OXT 基因的結(jié)合位點(diǎn)，提示 RARs其有轉(zhuǎn)錄活性。

圖 1-1 第一部分研究方案Figure 1-1 Workflow diagram of research in the first part..3.1 基本信息采集及體格測量患者基本信息包括姓名、性別、出生日期、年齡，疾病及近半年用藥史，母

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 畢楊;龔敏;何昀;張峗;陳潔;李廷玉;;腺病毒介導(dǎo)siRNA抑制全反式維甲酸誘導(dǎo)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞RARβ表達(dá)[J];生物工程學(xué)報(bào);2012年05期

2 毛春婷;李廷玉;;邊緣性維生素A缺乏及干預(yù)對(duì)幼鼠海馬神經(jīng)元形態(tài)與功能的影響[J];營養(yǎng)學(xué)報(bào);2010年05期

3 宋萃;李廷玉;;維生素A缺乏對(duì)胚胎主要器官系統(tǒng)形態(tài)構(gòu)建的影響[J];兒科藥學(xué)雜志;2006年06期

本文編號(hào)：2763149