【摘要】： 目的 先天性肛門直腸畸形(anorectal malformations,ARMs)是一種常見的消化道先天畸形,其發(fā)病率約為1/5000～1/1500,其病理改變復(fù)雜,術(shù)后并發(fā)癥多,嚴重影響患者的身心健康,是國內(nèi)外研究者一直高度關(guān)注的先天性畸形之一。 遺傳流行病學(xué)研究表明,先天性肛門直腸畸形的發(fā)生是遺傳因素和環(huán)境因素共同作用的結(jié)果。近幾年關(guān)于胚胎發(fā)育的基因調(diào)控等方面的研究發(fā)現(xiàn)shh(sonichedgehog)基因與胚胎發(fā)育的很多方面密切相關(guān),動物研究表明其在后腸的胚胎形態(tài)發(fā)生過程中起著重要作用,如在shh基因敲除鼠中可觀察到后腸發(fā)育異常導(dǎo)致的不同類型的肛門直腸畸形,但是人類肛門直腸畸形與shh基因的相關(guān)報道較少。為了研究人類先天性肛門直腸畸形與shh基因是否相關(guān),本文以shh基因為候選基因,選擇與該基因緊密連鎖的微衛(wèi)星標記D7s500,對46例先天性肛門直腸畸形核心家系進行等位基因檢測分析,對其中35例雜合子父母核心家系進行了傳遞連鎖不平衡檢驗(transmission disequilibrium test,TDT),以探討shh基因與人類先天性肛門直腸畸形的關(guān)系。 方法 1、標本來源 病例來源于中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院小兒外科。46例病例均為在我科經(jīng)手術(shù)治療確診的先天性肛門直腸畸形患兒。取患兒及其父母外周靜脈血1ml,EDTA(0.2mol/L,PH8.0,100μl)抗凝。 2、選取微衛(wèi)星DNA 選取與shh基因緊密連鎖的微衛(wèi)星DNA標記D7s500。該標記及其引物序列均選自人類基因數(shù)據(jù)庫(GDB),PCR引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。 3、基因型分析 (1)提取DNA 全血標本經(jīng)紅細胞裂解法提取白細胞后常規(guī)苯酚/氯仿法提取基因組DNA。 (2)PCR擴增微衛(wèi)星DNA PCR擴增按常規(guī)方法,在Biometra梯度PCR擴增儀上進行,反應(yīng)體系25μl。反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性3min,以94℃40s,57℃60s,72℃60s,循環(huán)35次,最后72℃延伸7min。用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物,條帶明亮單一者保存待用。 (3)分離檢測等位基因 取PCR產(chǎn)物5μl,經(jīng)12%(29:1)變性聚丙烯酰胺凝膠分離等位基因。600V恒電壓電泳適當時間(以氰化二甲苯晴蘭到達膠底部為標準)。電泳完畢后,用0.2%AgNO_3染色,3%Na_2CO_3和0.4%甲醛溶液顯色,雙盲法判讀等位基因型。 4、統(tǒng)計學(xué)分析 TDT分析要求運用雜合子父母未傳遞給子代的等位基因作對照,故排除純合子父母家系。對符合要求的家系根據(jù)等位基因傳遞/未傳遞的頻次建立TDT表格,采用SPSS12.0計算機軟件,進行傳遞連鎖不平衡檢驗及相關(guān)分析。 結(jié)果 1、D7s500位點穩(wěn)定分離出12個等位基因。 2、46例核心家系中,排除資料不全難以進行基因分型者5例及純合子父母家系6例,最后35例家系進行TDT分析。 3、微衛(wèi)星DNA D7s500等位基因10,雜合子型父母向子代傳遞等位基因的數(shù)目為10,未傳遞等位基因的數(shù)目為2,有顯著性差異(x~2=5.333,P＜0.05)。先天性肛門直腸畸形D7s500等位基因10存在傳遞連鎖不平衡。 結(jié)論 1、先天性肛門直腸畸形的D7s500位點等位基因10存在傳遞連鎖不平衡,shh基因可能與人類先天性肛門直腸畸形相關(guān)。 2、D7s500位點可以穩(wěn)定分離出12個等位基因片段。
【學(xué)位授予單位】：中國醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號】：R726.5
【圖文】：

遞的等位基因數(shù)。用SPSS12.0軟件進行傳遞連鎖不平衡檢驗及相關(guān)分析。結(jié)果1、在微衛(wèi)星標記D7s500處穩(wěn)定分離出12個等位基因。圖1為銀染聚丙烯酞胺電泳結(jié)果圖。2、35例家系可用于TDT分析。35例核心家系的等位基因型如表3所示。3、根據(jù)父母向子代傳遞/不傳遞的等位基因數(shù)建立TDT表格，并進行TDT檢驗及相關(guān)分析，結(jié)果如表4。其中微衛(wèi)星 DNAD7s5OO等位基因10，雜合子型父母向子代傳遞等位基因的數(shù)目為10，未傳遞等位基因的數(shù)目為2，有顯著性差異(才一5.333，P<0.05)。先天性肛門直腸畸形D7s500等位基因10存在傳遞連鎖不平衡。

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前3條

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本文編號：2758636