發(fā)布時間：2020-07-17 01:57

【摘要】：目的研究維生素D受體(VDR)基因FokI、BsmI、ApaI和TaqI位點多態(tài)性在廣西地區(qū)兒童的分布,分析VDR基因多態(tài)性與兒童急性白血病(AL)遺傳易感性之間的關(guān)系,以進一步了解AL的分子生物學(xué)機制。方法采用病例-對照的研究方法,在中國廣西地區(qū)選取無血緣關(guān)系的127例AL兒童和268例健康體檢兒童(作為對照組)作為研究對象,采集外周血,提取DNA,采用聚合酶鏈限制性片段長度多態(tài)性技術(shù)和基因測序技術(shù),對兩組兒童FokI、BsmI、ApaI和TaqI位點多態(tài)性進行分析。采用二項分布檢驗,對兩組數(shù)據(jù)進行Hardy-Weinberg遺傳平衡分析。組間頻率比較采用χ2檢驗,以比值比(OR)及95%可信區(qū)間(CI)表示相對風(fēng)險度。采用SHEsis軟件進行VDR基因多態(tài)性位點連鎖不平衡的計算。結(jié)果樣本經(jīng)遺傳平衡檢驗表明,各基因型的觀察值與期望值之間無顯著性差異(P0.05),說明所選的樣本具有代表性。268例健康兒童VDR基因FokI位點ff、Ff和FF基因型頻率分別為22.02%、48.13%和29.85%;f、F等位基因頻率為46.08%和53.92%。BsmI位點bb、Bb和BB基因型頻率分別為91.79%、7.84%和0.37%;b、B等位基因頻率為95.71%、4.29%。ApaI位點aa、Aa和AA基因型頻率分別為52.61%、36.57%和10.82%;a、A等位基因頻率為70.90%、29.10%。TaqI位點tt、Tt和TT基因型頻率分別為0%、9.70%和90.30%;t、T等位基因頻率為4.85%、95.15%。結(jié)果顯示廣西地區(qū)健康兒童FokI、BsmI、ApaI和TaqI位點多態(tài)性分布情況與國內(nèi)其它地區(qū)分布基本一致。127例AL兒童ff、Ff和FF基因型頻率分別為35.43 %、43.31%和21.26%;f、F等位基因頻率為57.09%、42.91%。bb、Bb和BB基因型頻率分別為92.13%、7.87%和0;b、B等位基因頻率為96.06%、3.94%。aa、Aa和AA基因型頻率分別為48.82%、37.01%和14.17%;a、A等位基因頻率為67.32%、32.68%。tt、Tt和TT基因型頻率分別為0、11.81%和88.19%;t、T等位基因頻率為5.91%、94.09%。FokI位點ff基因型在AL兒童的分布較健康兒童明顯增高。與FF基因型相比,ff基因型患AL的風(fēng)險性增加(OR=2.260,P0.05);與F等位基因相比,攜帶f等位基因的個體更易罹患AL(OR=1.556,P0.05)。BsmI、ApaI和TaqI位點多態(tài)性分布在病例組與對照組之間無顯著性差異。FokI和BsmI、ApaI、TaqI位點之間不存在明顯的連鎖不平衡。結(jié)論中國廣西地區(qū)兒童VDR基因多態(tài)性分布頻率有其自身的特點。VDR基因FokI位點SNP可能是急性白血病發(fā)生的遺傳易感因素之一,攜帶f等位基因的個體更易罹患急性白血病。VDR基因BsmI、ApaI和TaqI酶切位點的多態(tài)性可能與兒童白血病的遺傳易感性無關(guān)。此結(jié)論仍需進一步行大樣本實驗證實。 目的通過檢測AL兒童VDR基因和蛋白的表達,從轉(zhuǎn)錄和翻譯兩個水平探討VDR在AL中表達的意義,揭示VDR的表達與AL分類的可能聯(lián)系。方法收集未經(jīng)治療的30例急性淋巴細胞白血病(ALL)和12例急性髓細胞白血病(AML)兒童、30例非腫瘤性血液病兒童(包括缺鐵性貧血、溶血性貧血、特發(fā)性血小板減少性紫癜等,作為對照組)的骨髓標(biāo)本,抽提總RNA,提取得到的RNA采用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈,以逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板,應(yīng)用SYBR Green I實時熒光定量PCR方法,檢測VDR基因mRNA的表達。擴增產(chǎn)物的特異性通過熔解曲線和瓊脂糖凝膠電泳雙重確認(rèn)。以管家基因GAPDH基因為內(nèi)參照,采用2-△△Ct法計算VDR mRNA的相對表達量,得到標(biāo)化的VDR mRNA的表達。利用超敏S-P免疫細胞化學(xué)法檢測了其中9例AL兒童和4例對照組骨髓細胞VDR的表達。收集未經(jīng)治療的30例ALL、10例AML和30例健康體檢兒童(作為對照組)的外周血標(biāo)本,提取單個核細胞(MNCs),取適量立即涂片應(yīng)用免疫細胞化學(xué)法檢測VDR的表達和定位情況;其余的MNCs用細胞裂解液抽提全細胞蛋白樣品用于蛋白免疫印跡法檢測VDR蛋白的相對表達量。用單因素方差分析比較ff、Ff和FF三種基因型VDR mRNA和蛋白表達的差異。對AL兒童VDR的表達和外周血白細胞、血小板的關(guān)系進行一元線性相關(guān)分析。結(jié)果VDR mRNA在所有檢測的AL兒童和對照組兒童的骨髓中均有表達。ALL兒童VDR mRNA的表達(1.06±0.31)和AML的表達(1.13±0.34)明顯低于對照組兒童的表達(3.10±0.18),組間有顯著性差異(F=1701.00,P0.01),而ALL和AML之間的表達無統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。經(jīng)一元線性相關(guān)分析,結(jié)果顯示42例AL兒童VDR mRNA的表達水平與外周血白細胞數(shù)無明顯相關(guān)性(r=0.045, P=0.078),與外周血血小板數(shù)亦無明顯相關(guān)性(r=0.067, P=0.675)。對42例AL兒童ff、Ff和FF三種基因型進行VDR mRNA表達的比較,VDR mRNA的表達分別為1.25±0.47(n=12),1.12±0.41(n=17),1.09±0.38(n=13),組間比較無統(tǒng)計學(xué)差異(F=0.489,P 0.05)。免疫細胞化學(xué)法顯示所檢測樣本的骨髓和外周血MNCs均表達VDR蛋白,VDR蛋白主要分布在細胞核內(nèi)。被檢測的9例AL兒童骨髓VDR蛋白的表達(30.80±1.56%)低于4例對照組兒童的表達(62.45±3.73%),由于樣本例數(shù)太少,未作統(tǒng)計學(xué)分析。30例ALL兒童外周血VDR蛋白的表達(27.82±1.78%)和10例AML的表達(27.10±2.44%)明顯低于30例健康兒童(59.02±3.46%),組間有顯著差異(F=1150.26,P0.01),而ALL和AML兒童中VDR蛋白的表達無統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。蛋白免疫印跡法亦顯示相似結(jié)果:ALL兒童VDR蛋白的表達(0.299±0.071)和AML的表達(0.290±0.094)明顯低于健康兒童(0.710±0.041),組間有顯著差異(F=356.434,P 0.01),而ALL和AML兒童VDR蛋白的表達無統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。一元線性相關(guān)分析顯示40例AL兒童VDR蛋白的表達水平與外周血白細胞數(shù)無明顯相關(guān)性(r=-0.133, P=0.413),與外周血血小板數(shù)亦無無直線相關(guān)關(guān)系(r=0.006,P=0.917)。病例組40例AL兒童ff、Ff和FF基因型VDR蛋白的表達分別為0.286±0.061(n=13),0.289±0.079(n=17), 0.324±0.089(n=10),組間比較無統(tǒng)計學(xué)意義(F=0.853,P0.05)。結(jié)論所有檢測的AL兒童的骨髓和外周血MNCs均表達VDR,考慮白血病細胞是VDR 作用的靶細胞。AL兒童VDR mRNA和蛋白的表達較健康兒童明顯降低,考慮VDR的表達情況可能成為AL診斷的有效指標(biāo)。VDR的表達可能與AL分類、VDR基因型和初治時外周血象無關(guān)。 目的研究不同濃度的1,25二羥基維生素D3(1,25(OH)2D3)對人白血病細胞株6T-CEM和HL-60生長、分化和凋亡的影響,并觀察1,25(OH)2D3處理前后6T-CEM和HL-60細胞VDR mRNA和蛋白表達的變化,探討其抗白血病的分子機制及用于白血病治療的可行性。方法在體外培養(yǎng)條件下,用不同濃度(10-9,10-8,10-7,10-6 mol/L)的1,25(OH)2D3作用處于對數(shù)生長期的6T-CEM和HL-60。應(yīng)用臺盼藍拒染法計數(shù)活細胞,甲基噻唑基四唑(MTT)比色法分析細胞增殖抑制作用,硝基四氮唑藍(NBT)還原實驗法分析HL-60細胞的分化指標(biāo),末端脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記染色法(TUNEL)檢測細胞晚期凋亡的變化,倒置顯微鏡及賴-吉染色法(Wright-Giemsa)觀察細胞形態(tài)學(xué)改變,運用RT FQ-PCR方法檢測VDR mRNA變化,免疫細胞化學(xué)法和蛋白免疫印跡技術(shù)檢測VDR蛋白表達。結(jié)果MTT法顯示不同濃度的1,25(OH)2D3作用后可抑制6T-CEM及HL-60細胞的生長,呈劑量和時間依賴性。不同濃度的1,25(OH)2D3作用后可誘導(dǎo)HL-60細胞向成熟粒細胞分化,對6T-CEM的分化無影響。TUNEL法顯示1,25(OH)2D3作用后對6T-CEM和HL-60細胞有明顯的促細胞凋亡作用,凋亡率隨藥物濃度的增高而增高。細胞形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)藥物作用后細胞表現(xiàn)出凋亡的形態(tài)特征。1,25(OH)2D3作用前后6T-CEM和HL-60細胞均表達VDR mRNA和蛋白,藥物作用前后VDR mRNA表達改變不明顯,而VDR蛋白表達上調(diào)。結(jié)論1,25(OH)2D3在一定濃度范圍內(nèi)可抑制6T-CEM和HL-60細胞增殖,誘導(dǎo)細胞凋亡。1,25(OH)2D3可誘導(dǎo)HL-60細胞向成熟粒細胞分化。1,25(OH)2D3可使6T-CEM和HL-60細胞VDR蛋白表達上調(diào),但不改變VDR mRNA水平。
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R733.7
【圖文】：

圖 1-1 VDR 基因 PCR 產(chǎn)物瓊脂糖電泳結(jié)果Figure 1-1 The AGE result of VDR gene PCR product.2 PCR-RFLP 結(jié)果PCR 反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶作用后，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳,根據(jù)切得到的 DNA 片段長度判斷基因型(圖 1-2)。用小寫字母表示存在酶切位，大寫字母表示缺乏酶切位點。分型標(biāo)準(zhǔn)：FF 基因型有一條電泳帶246bp)，ff 基因型有兩條電泳帶(195bp、51bp)，F(xiàn)f 基因型有三條電泳帶246bp、 195bp、51bp)；BB 基因型有一條電泳帶(577bp),bb 基因型有兩電泳帶(411bp、166bp)，Bb 基因型有三條電泳帶(577bp、411bp、166bp)；A 基因型有一條電泳帶(745bp)，aa 基因型有兩條電泳帶(525bp、220bp)，

29圖 1-2 VDR基因4個SNPS的PCR-RFLP瓊脂糖電泳結(jié)果Figure 1-2 The AGE result of PCR-RFLP product of VDR gene3.3 遺傳平衡檢驗根據(jù)群體遺傳學(xué)的原理，只有符合 Hardy-Weinberg 遺傳平衡規(guī)體之間才具有可比性[44]。為了檢驗所研究樣本的 VDR 基因型頻率是群體代表性，對調(diào)查對象的基因型頻率進行了 Hardy-Weinberg 平衡結(jié)果表明，所有檢測樣本基因型的觀察值與期望值差異無顯著性(P>

處有最大吸收峰，因此，可以用 260nm 波長光測定 RNA 濃度。1 個 OD 的密度值相當(dāng)于大約 40μg /ml 的單鏈 RNA，RNA 濃度(μg/m1)=OD260×稀釋數(shù)×40/1000。RNA 純度=OD260/OD280。若比值較低，說明有殘余蛋白質(zhì)存在比值太高，則提示 RNA 有降解。我們選用 OD260/OD280介于 1.8-2.1 的純較好的 RNA 用于后續(xù)實驗。3.1.2 RNA 的質(zhì)量鑒定2％瓊脂糖電泳結(jié)果觀察到凝膠上有 28s、18s、5s 三條條帶，28S 18S 條帶清晰，且 28S 的亮度在 18S 的兩倍以上，說明 RNA 純度高并且沒降解，可以認(rèn)為我們抽提的 RNA 的質(zhì)量是好的(圖 2-1)。

【參考文獻】

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本文編號：2758822