【摘要】： 目的：對小兒腎母細胞瘤新型疫苗進行初步探索、研究，為小兒腎母細胞瘤的治療以及替代手術后放、化療提供新的切入點。 方法：首先對必需的實驗材料進行制備和驗證，包括抗體的制備和腫瘤細胞模型的建立。針對小兒腎母細胞瘤WT1基因，選取三段抗原表位肽HLA-A*0201、HLA-A*2402以及經(jīng)過修飾的HLA-A*2402(命名為HLA-A*2402x)，采用短肽合成及Balb／c小鼠免疫檢測的方法篩選最佳的抗原表位肽，為小兒腎母細胞瘤新型疫苗的研究奠定基礎。用篩選得到的表位肽HLA-A*2402、HLA-A*2402x分別構建DNA疫苗，為最終研制新型疫苗作對照。采用基因重組技術分別將克隆編碼的小兒腎母細胞瘤WT1表位肽HLA-A*2402、HLA-A*2402x融合到乙型肝炎核蛋白基因片段(HBc)上，運用棒狀桿菌表達系統(tǒng)對融合蛋白進行表達，通過電鏡觀察到的融合蛋白呈病毒樣顆粒(VLP)。繼而采用免疫熒光技術和WB技術對表達的蛋白進行鑒定。將鑒定好的VLP蛋白和DNA疫苗應用于細胞模型進行研究，然后，分別免疫Balb／c小鼠，采用ELISA、FCM、MTT等免疫學實驗技術分別檢測，初步判斷基于WT1表位肽HLA-A*2402、HLA-A*2402x構建的以VLP為呈現(xiàn)載體的重組蛋白，應用于治療小兒腎母細胞瘤以及探討替代手術后放、化療的可行性。 結果： (1)制備完成合格的實驗材料：對小兒腎母細胞瘤細胞進行了成功的原代培養(yǎng)，建立了細胞系用于實驗研究；克隆了WT1基因部分片段的原核表達質粒，表達并純化了蛋白，免疫家兔，采集血清制備了針對WT1的多克隆抗體。 (2)MTS及FCM初步證明，合成短肽HLA-A*2402，HLA-A*2402x在刺激淋巴細胞增殖方面優(yōu)于HLA-A*0201，而前兩者無顯著性差異(p＞0.05)。因此，我們選擇HLA-A*2402，HLA-A*2402x作為進一步研究的對象。 (3)構建了含有HLA-A*2402，HLA-A*2402x的兩種DNA疫苗，雙酶切及測序結果證明構建成功。 (4)在HBc與HLA-A*2402，HLA-A*2402x偶聯(lián)(couple)基礎上，構建完成以VLP為呈現(xiàn)載體的新型疫苗，雙酶切和測序結果證明構建成功。成功運用棒狀桿菌表達系統(tǒng)對偶聯(lián)蛋白進行表達，并得到WB和電鏡檢測證實。 (5)運用以VLP為呈現(xiàn)載體的新型疫苗免疫Balb／c小鼠，并以構建的DNA疫苗作為對照，結果表明以VLP為呈現(xiàn)載體的新型疫苗免疫小鼠產(chǎn)生了有效的特異性體液免疫和細胞免疫�？贵w亞型分類表明特異性IgG1／IgG2a小于1，說明產(chǎn)生了Th1型為主的免疫應答。T淋巴細胞增殖試驗證實免疫小鼠脾臟T淋巴細胞對ConA誘導的增殖反應增強；ELISPOT分析表明疫苗免疫組的特異性活化的可分泌IFN-γ的CD8~+T細胞數(shù)顯著多于對照組；FCM檢測表明，疫苗免疫組的CD4~+／CD8~+比值顯著低于對照組。這些結果提示以VLP為呈現(xiàn)載體的新型疫苗誘導了特異性CD8~+T淋巴細胞應答，所激發(fā)的細胞免疫和體液免疫均明顯優(yōu)于DNA疫苗對照組。 結論：所制備的小兒腎母細胞瘤以VLP為呈現(xiàn)載體的新型疫苗在小鼠體內(nèi)可同時激發(fā)體液免疫和細胞免疫，優(yōu)于相應的DNA疫苗，為小兒腎母細胞瘤的免疫治療提供了新的方法和思路。更為重要的是能將病毒有關成分引入到小兒腎母細胞瘤的免疫治療。
【學位授予單位】：中國人民解放軍軍醫(yī)進修學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2007
【分類號】：R737.11
【圖文】：

小兒腎母細胞瘤免疫治療的初步研究圖2FigZ鼠源性腎母細胞瘤組織病理切片 WilmstumorPathologiealseetion.3多克隆抗體的制備:運用ELISA方法檢測制備的抗體效價可達到1:64000，因為是針對腫瘤多種蛋白的抗體，分析針對WTI的抗體效價可能沒有那么高，因此在以后的實驗中需要對有效抗體濃度進行實際驗證。以上研究表明，我們己經(jīng)成功的建立了小兒腎母細胞瘤的細胞系，同時通過動物模型的建立制備了鼠源性小兒腎母細胞瘤的腫瘤細胞;制備了高效價的腫瘤多克隆抗體。以上結果為本實驗研究的順利進行奠定了基礎。

三、實驗結果 3.1HLA一A*0201一HBe/veDNA:3.1(+)、HLA一A*2402一HBe/peDNA:玉.1(+)、llLA一A*2402x一HBe/peDNA3.1(+)PCR及雙酶切鑒定(圖3):圖3重組真核質粒PCR和雙酶切鑒定 F19:虧 engymedigestionandPCRofrceombinantplasmidpeDNA:飛.1(+):A，IllA一A*0201一HBe/peDNA:虧.1(+);B，HIA一A*2402一11Be/peDNA;3.1(+)C，IllA一A*2402x一l{Be/peDNA:3.1(+)三種重組質粒經(jīng)過PCR和雙酶切進行初步鑒定，結果如上圖所示，PCR和酶切目的條帶與預期大小一致。

軍醫(yī)進修學院博士學位論文 3.2HLA一A*0201一HBe/peDNA3.l(+)、HLA一A*2402一HBe/pcDNA3.l(+)、HLA一A*2402x一HBe/ pcDNA3.1(+)COS一7細胞瞬時表達免疫細胞化學結果(圖4):圖4重組DNA疫苗在COS一7細胞的瞬時表達 Fig4ExpressionofDNAvaeeineinCOS一7:A， negativeeontro1B，一A*0201一HBe/peDNA3.1(+)C，HLA一A*2402一HBe/peDNA3.1(+)D，HLA一A*2402x一HBe/peDNA3.1(+)運用COS一7細胞進行瞬時表達，結果顯示如上圖。B、C、D為重組質粒轉染免疫細胞化學結果，圖中細胞內(nèi)可明顯地觀察到黃褐色顆粒，即為表達的重組蛋白。所有的重組質粒在COS一細胞中都能夠瞬時表達，為進一步實驗奠定基礎。3.3候選DNA疫苗免疫小鼠淋巴細胞亞群分析:

【參考文獻】

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本文編號：2757030