【摘要】： 目的：對(duì)小兒腎母細(xì)胞瘤新型疫苗進(jìn)行初步探索、研究，為小兒腎母細(xì)胞瘤的治療以及替代手術(shù)后放、化療提供新的切入點(diǎn)。 方法：首先對(duì)必需的實(shí)驗(yàn)材料進(jìn)行制備和驗(yàn)證，包括抗體的制備和腫瘤細(xì)胞模型的建立。針對(duì)小兒腎母細(xì)胞瘤WT1基因，選取三段抗原表位肽HLA-A*0201、HLA-A*2402以及經(jīng)過(guò)修飾的HLA-A*2402(命名為HLA-A*2402x)，采用短肽合成及Balb／c小鼠免疫檢測(cè)的方法篩選最佳的抗原表位肽，為小兒腎母細(xì)胞瘤新型疫苗的研究奠定基礎(chǔ)。用篩選得到的表位肽HLA-A*2402、HLA-A*2402x分別構(gòu)建DNA疫苗，為最終研制新型疫苗作對(duì)照。采用基因重組技術(shù)分別將克隆編碼的小兒腎母細(xì)胞瘤WT1表位肽HLA-A*2402、HLA-A*2402x融合到乙型肝炎核蛋白基因片段(HBc)上，運(yùn)用棒狀桿菌表達(dá)系統(tǒng)對(duì)融合蛋白進(jìn)行表達(dá)，通過(guò)電鏡觀(guān)察到的融合蛋白呈病毒樣顆粒(VLP)。繼而采用免疫熒光技術(shù)和WB技術(shù)對(duì)表達(dá)的蛋白進(jìn)行鑒定。將鑒定好的VLP蛋白和DNA疫苗應(yīng)用于細(xì)胞模型進(jìn)行研究，然后，分別免疫Balb／c小鼠，采用ELISA、FCM、MTT等免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)分別檢測(cè)，初步判斷基于WT1表位肽HLA-A*2402、HLA-A*2402x構(gòu)建的以VLP為呈現(xiàn)載體的重組蛋白，應(yīng)用于治療小兒腎母細(xì)胞瘤以及探討替代手術(shù)后放、化療的可行性。 結(jié)果： (1)制備完成合格的實(shí)驗(yàn)材料：對(duì)小兒腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞進(jìn)行了成功的原代培養(yǎng)，建立了細(xì)胞系用于實(shí)驗(yàn)研究；克隆了WT1基因部分片段的原核表達(dá)質(zhì)粒，表達(dá)并純化了蛋白，免疫家兔，采集血清制備了針對(duì)WT1的多克隆抗體。 (2)MTS及FCM初步證明，合成短肽HLA-A*2402，HLA-A*2402x在刺激淋巴細(xì)胞增殖方面優(yōu)于HLA-A*0201，而前兩者無(wú)顯著性差異(p＞0.05)。因此，我們選擇HLA-A*2402，HLA-A*2402x作為進(jìn)一步研究的對(duì)象。 (3)構(gòu)建了含有HLA-A*2402，HLA-A*2402x的兩種DNA疫苗，雙酶切及測(cè)序結(jié)果證明構(gòu)建成功。 (4)在HBc與HLA-A*2402，HLA-A*2402x偶聯(lián)(couple)基礎(chǔ)上，構(gòu)建完成以VLP為呈現(xiàn)載體的新型疫苗，雙酶切和測(cè)序結(jié)果證明構(gòu)建成功。成功運(yùn)用棒狀桿菌表達(dá)系統(tǒng)對(duì)偶聯(lián)蛋白進(jìn)行表達(dá)，并得到WB和電鏡檢測(cè)證實(shí)。 (5)運(yùn)用以VLP為呈現(xiàn)載體的新型疫苗免疫Balb／c小鼠，并以構(gòu)建的DNA疫苗作為對(duì)照，結(jié)果表明以VLP為呈現(xiàn)載體的新型疫苗免疫小鼠產(chǎn)生了有效的特異性體液免疫和細(xì)胞免疫�？贵w亞型分類(lèi)表明特異性IgG1／IgG2a小于1，說(shuō)明產(chǎn)生了Th1型為主的免疫應(yīng)答。T淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)證實(shí)免疫小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞對(duì)ConA誘導(dǎo)的增殖反應(yīng)增強(qiáng)；ELISPOT分析表明疫苗免疫組的特異性活化的可分泌IFN-γ的CD8~+T細(xì)胞數(shù)顯著多于對(duì)照組；FCM檢測(cè)表明，疫苗免疫組的CD4~+／CD8~+比值顯著低于對(duì)照組。這些結(jié)果提示以VLP為呈現(xiàn)載體的新型疫苗誘導(dǎo)了特異性CD8~+T淋巴細(xì)胞應(yīng)答，所激發(fā)的細(xì)胞免疫和體液免疫均明顯優(yōu)于DNA疫苗對(duì)照組。 結(jié)論：所制備的小兒腎母細(xì)胞瘤以VLP為呈現(xiàn)載體的新型疫苗在小鼠體內(nèi)可同時(shí)激發(fā)體液免疫和細(xì)胞免疫，優(yōu)于相應(yīng)的DNA疫苗，為小兒腎母細(xì)胞瘤的免疫治療提供了新的方法和思路。更為重要的是能將病毒有關(guān)成分引入到小兒腎母細(xì)胞瘤的免疫治療。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類(lèi)號(hào)】：R737.11
【圖文】：

小兒腎母細(xì)胞瘤免疫治療的初步研究圖2FigZ鼠源性腎母細(xì)胞瘤組織病理切片 WilmstumorPathologiealseetion.3多克隆抗體的制備:運(yùn)用ELISA方法檢測(cè)制備的抗體效價(jià)可達(dá)到1:64000，因?yàn)槭轻槍?duì)腫瘤多種蛋白的抗體，分析針對(duì)WTI的抗體效價(jià)可能沒(méi)有那么高，因此在以后的實(shí)驗(yàn)中需要對(duì)有效抗體濃度進(jìn)行實(shí)際驗(yàn)證。以上研究表明，我們己經(jīng)成功的建立了小兒腎母細(xì)胞瘤的細(xì)胞系，同時(shí)通過(guò)動(dòng)物模型的建立制備了鼠源性小兒腎母細(xì)胞瘤的腫瘤細(xì)胞;制備了高效價(jià)的腫瘤多克隆抗體。以上結(jié)果為本實(shí)驗(yàn)研究的順利進(jìn)行奠定了基礎(chǔ)。

三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果 3.1HLA一A*0201一HBe/veDNA:3.1(+)、HLA一A*2402一HBe/peDNA:玉.1(+)、llLA一A*2402x一HBe/peDNA3.1(+)PCR及雙酶切鑒定(圖3):圖3重組真核質(zhì)粒PCR和雙酶切鑒定 F19:虧 engymedigestionandPCRofrceombinantplasmidpeDNA:飛.1(+):A，IllA一A*0201一HBe/peDNA:虧.1(+);B，HIA一A*2402一11Be/peDNA;3.1(+)C，IllA一A*2402x一l{Be/peDNA:3.1(+)三種重組質(zhì)粒經(jīng)過(guò)PCR和雙酶切進(jìn)行初步鑒定，結(jié)果如上圖所示，PCR和酶切目的條帶與預(yù)期大小一致。

軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院博士學(xué)位論文 3.2HLA一A*0201一HBe/peDNA3.l(+)、HLA一A*2402一HBe/pcDNA3.l(+)、HLA一A*2402x一HBe/ pcDNA3.1(+)COS一7細(xì)胞瞬時(shí)表達(dá)免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果(圖4):圖4重組DNA疫苗在COS一7細(xì)胞的瞬時(shí)表達(dá) Fig4ExpressionofDNAvaeeineinCOS一7:A， negativeeontro1B，一A*0201一HBe/peDNA3.1(+)C，HLA一A*2402一HBe/peDNA3.1(+)D，HLA一A*2402x一HBe/peDNA3.1(+)運(yùn)用COS一7細(xì)胞進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)，結(jié)果顯示如上圖。B、C、D為重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果，圖中細(xì)胞內(nèi)可明顯地觀(guān)察到黃褐色顆粒，即為表達(dá)的重組蛋白。所有的重組質(zhì)粒在COS一細(xì)胞中都能夠瞬時(shí)表達(dá)，為進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。3.3候選DNA疫苗免疫小鼠淋巴細(xì)胞亞群分析:

【參考文獻(xiàn)】

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1 葉惟靖,劉國(guó)華,徐卯升,朱亞忠,王耀平,林梓,周昕;Wilms瘤的免疫治療:附8例報(bào)告[J];臨床兒科雜志;2000年01期

2 蘇誠(chéng),劉唐彬,謝家倫,莫家,詹文華;雙側(cè)腎母細(xì)胞瘤的診治與預(yù)后[J];臨床兒科雜志;2003年06期

3 曾政,王英,趙光宇,周華,于三科,韓岳,羅德炎,馬麗娟,王希良;布氏桿菌pCDNA3.1-L7L12核酸疫苗的構(gòu)建及其免疫學(xué)評(píng)價(jià)[J];免疫學(xué)雜志;2004年03期

4 唐達(dá)星,李民駒,章希圣,湯宏峰;腎母細(xì)胞瘤術(shù)前化療的優(yōu)劣分析[J];實(shí)用腫瘤雜志;2001年01期

5 湯靜燕,潘慈,徐敏,薛惠良,陳靜,趙惠君,顧龍君,王耀平;上海兒童醫(yī)學(xué)中心WT-99方案診治兒童腎母細(xì)胞瘤臨床報(bào)告[J];中華兒科雜志;2003年02期

6 李守林,王軍,董勤光,孫崇偉;術(shù)前化療對(duì)腎母細(xì)胞瘤瘤體的影響[J];中華小兒外科雜志;2002年04期

本文編號(hào)：2757030