發(fā)布時(shí)間：2020-07-15 04:32

【摘要】：目的:探討微管相關(guān)錯(cuò)義突變基因微管相關(guān)腫瘤抑制因子1(Microtubule-associated tumor suppressor 1,MTUS1)在心肌致密化發(fā)生過(guò)程中的作用,初步闡述心肌致密化不全的遺傳學(xué)發(fā)生機(jī)制。方法:首先在CP15-5a細(xì)胞系水平構(gòu)建過(guò)表達(dá)慢病毒突變組LV-M-MTUS1、野生組LV-W-MTUS1及空載組CON,采用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)各組MTUS1及小GTP酶RhoA(ras homolog family member A,RhoA)的mRNA表達(dá)水平,Western blot技術(shù)檢測(cè)各組RhoA蛋白表達(dá)水平,細(xì)胞免疫熒光技術(shù)檢測(cè)各組α-tubulin熒光表達(dá)強(qiáng)度,并對(duì)各組細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn),檢測(cè)其細(xì)胞遷移情況;其次在HEK-293細(xì)胞系水平構(gòu)建過(guò)表達(dá)慢病毒突變組LV-M-MTUS1、野生組LV-W-MTUS1及空載組CON,采用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)各組MTUS1 mRNA表達(dá)水平,細(xì)胞免疫熒光技術(shù)檢測(cè)各組α-tubulin、α/β-tubulin及極性蛋白PAR6的熒光表達(dá)強(qiáng)度及細(xì)胞定位情況,同時(shí)根據(jù)α-tubulin熒光結(jié)果檢測(cè)HEK-293細(xì)胞分裂期子代細(xì)胞紡錘體到胞膜的距離及分裂后子代細(xì)胞大小,Western blot技術(shù)檢測(cè)各組Rac1/Cdc42蛋白磷酸化表達(dá)水平。結(jié)果:成功構(gòu)建過(guò)表達(dá)慢病毒突變組、野生組及空載組CP15-5a及HEK-293細(xì)胞模型;在CP15-5a細(xì)胞模型中,突變組與野生組相比,細(xì)胞α-tubulin熒光強(qiáng)度表達(dá)下降(P0.01),細(xì)胞內(nèi)α-tubulin較稀疏、紊亂。與野生組相比,突變組RhoA的mRNA及蛋白表達(dá)水平明顯增高(P0.01)。劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與野生組相比,在劃痕后6 h、12 h突變組細(xì)胞遷移速率增快(P0.01);在HEK-293細(xì)胞模型中,突變組及野生組MTUS1 mRNA表達(dá)明顯升高(P0.05);突變組與野生組相比,細(xì)胞α-tubulin熒光強(qiáng)度表達(dá)下降(P0.01),作為運(yùn)輸作用的α/β-tubulin熒光強(qiáng)度表達(dá)升高(P0.01),并且在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有濃聚的表現(xiàn);同時(shí)極性蛋白PAR6在突變組細(xì)胞內(nèi)表達(dá)增加(P0.01),定位更偏向細(xì)胞膜側(cè);根據(jù)α-tubulin細(xì)胞免疫熒光結(jié)果,突變組分裂期子代細(xì)胞紡錘體到胞膜的距離差值較野生組的距離差值明顯增加(P0.01),并且突變組分裂末期的子代細(xì)胞體積較野生組明顯增加(P0.01);突變組與野生組相比,磷酸化Rac1/Cdc42蛋白表達(dá)下降(P0.01)。結(jié)論:在CP15-5a細(xì)胞模型中,錯(cuò)義突變MTUS1能夠降低細(xì)胞微管穩(wěn)定性,并通過(guò)升高RhoA mRNA及蛋白水平,進(jìn)而影響細(xì)胞遷移能力;在HEK-293細(xì)胞模型中,錯(cuò)義突變MTUS1影響α-tubulin表達(dá),降低細(xì)胞微管穩(wěn)定,進(jìn)而影響細(xì)胞極性分裂情況,其可能的作用機(jī)制是微管穩(wěn)定性降低后,進(jìn)一步降低Rac1/Cdc42磷酸化蛋白水平,使調(diào)控運(yùn)輸?shù)摩?β-tubulin蛋白表達(dá)增加,促進(jìn)PAR6蛋白從胞質(zhì)運(yùn)輸至胞膜位置,導(dǎo)致細(xì)胞極性分裂趨勢(shì)增加;綜上,錯(cuò)義突變MTUS1可促進(jìn)心肌致密化的進(jìn)程,從而降低或者緩解心肌致密化不全的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn),是心肌致密化不全發(fā)生的保護(hù)性突變。
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R725.4
【圖文】：

Table 4 5% SDS-PAGE spacer gel （6ml）試劑名稱 加入體積（ml）ddH2O 4.130%Acr-Bis(29:1) 11M Tris, pH6.8 0.7510%SDS 0.0610%AP 0.06TEMED 0.006方法 實(shí)驗(yàn)技術(shù)路線

圖 1-2 考馬斯亮藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)曲線 Y=0.0695X+0.1453 相關(guān)性 R2=0.9906Figure 1-2 The standard curve of Bradford，Y=0.0695X+0.1453，R2=0.99.2 蛋白濃度測(cè)定）空白孔加 195 μl 考馬斯藍(lán)試劑，ddH2O 補(bǔ)齊至 200 μl；樣本孔試劑，2 μl 樣本，ddH2O 加 3 μl，反應(yīng)體系總體積為 200 μl；）移液槍吹勻反應(yīng)液，注意不要產(chǎn)生氣泡，置于酶標(biāo)儀測(cè)定 OD3 ） 根 據(jù) 考 馬 斯 藍(lán) 標(biāo) 準(zhǔn) 曲 線 測(cè) 得 系 數(shù) ， 帶 入 下 述 公 ，求得數(shù)值即為蛋白濃度（μg/μl）。 Western blot 檢測(cè)各組細(xì)胞 GFP 蛋白表達(dá)水平）配膠：

先證者姑姑；2：先證者父親；3：先證者母親；4：先證者：5：先證者圖 1-1 LVNC 家系Figure 1-1 LVNC family pedigreeitus’ aunt; 2. Propositus’ father; 3. Propositus’ mother; 4. Propositus; 5. sister(1）、（3）、（4）、（5）分別對(duì)應(yīng)家系圖譜

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 謝朝暉;陳蘭英;;細(xì)胞骨架研究進(jìn)展[J];癌變·畸變·突變;2011年04期

本文編號(hào)：2755985