【摘要】：第一部分重慶地區(qū)急性呼吸道感染住院患兒腺病毒感染流行病學研究和臨床特征分析目的:腺病毒(Ad V)是引起6月-2歲嬰幼兒重癥肺炎的病毒病原體,目前已報道有70種血清型,前期研究顯示不同血清型Ad V引起疾病的嚴重程度不同。本研究擬通過回顧性分析2009-2015年急性呼吸道感染住院患兒Ad V感染情況,探討重慶地區(qū)Ad V流行病學特征,以及不同血清型Ad V的臨床特征。方法:1.收集2009年6月至2015年5月期間因急性呼吸道感染(Acute Respiratory Tract Infection,ARTI)在重慶醫(yī)科大學附屬兒童醫(yī)院呼吸科病房住院且確診為Ad V感染患兒的鼻咽抽吸物(Nasopharyngeal aspirates,NAPs),共計4982份。2.提取NAPs中病毒脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid,DNA),使用聚合酶聯(lián)反應(Polymerase Chain Reaction,PCR)擴增腺病毒DNA后分別行六鄰體(hexon)、纖毛蛋白(fiber)基因測序,結果與Gen Bank中的序列BLAST比對分型。3.回顧性分析Ad V導致急性呼吸道感染住院患兒臨床特征,分析比較3、7型腺病毒所致疾病嚴重度差異。結果:1.連續(xù)6年重慶地區(qū)腺病毒檢出率為5.8%(289/4982)。2.主要的流行血清型為3型腺病毒(43.9%,127/289)和7型腺病毒(45.3%,131/289);3.腺病毒終年流行,高發(fā)季節(jié)在夏、冬季。4.腺病毒感染以男性和5歲以下兒童多見。5.7型腺病毒較3型腺病毒引起了更嚴重的疾病。結論:3、7型腺病毒是引起重慶地區(qū)急性呼吸道感染住院患兒最主要的血清型,7型腺病毒感染患兒較3型腺病毒感染病情更重。第二部分3、7型腺病毒纖毛蛋白差異對其致病力影響目的:本研究第一部分結果提示7型腺病毒的致病性比3型腺病毒更強,課題組前期研究發(fā)現(xiàn)3、7型腺病毒序列差異主要在纖毛蛋白上,提示纖毛蛋白差異可能參與了3、7型腺病毒的致病力不同,有關這方面的研究尚未見相關文獻報道。因此本部分擬進一步探討3、7型腺病毒纖毛蛋白差異是否影響其致病力。方法:1.使用臨床株3型腺病毒(CQ5291)、7型腺病毒(CQ4411)分別感染A549、16HBE和293細胞48小時(hour,h)后收取細胞懸液,通過定量聚合酶聯(lián)反應(Quantitative polymerase chain reaction,QPCR)定量病毒的拷貝數(shù);3型腺病毒、7型腺病毒以及3、7型腺病毒重組Ad3/H7株(human adenovirus type 3 packaged by type 7 hexon,Ad3/H7)感染A549細胞后0、4、8、12、24、36、48、60、72、96h收集細胞懸液,通過TCID50測定上述時間點的病毒滴度;3型腺病毒與7型腺病毒以1:1混合感染A549細胞后0、2、8、12、24、36、48、72h收取細胞懸液,通過Q-PCR定量病毒拷貝數(shù)。2.3、7型腺病毒以及重組腺病毒Ad3/H7株分別以MOI為250、25vp/cell感染A549細胞后2、4、24、36、48及60h加入CCK-8溶液作用30min,波長450nm讀取吸光值,計算細胞毒性結果。3.體外用純化的3型腺病毒、7型腺病毒以及重組腺病毒Ad3/H7株與正常健康人血清孵育以檢測補體C3a產(chǎn)物。4.BALB/c小鼠鼻內(nèi)接種3型腺病毒、7型腺病毒以及重組腺病毒Ad3/H7株建立腺病毒下呼吸道感染動物模型,每天監(jiān)測小鼠體重變化,分別在感染后第3、5、7天收集標本。觀察腺病毒感染后肺組織勻漿是否出現(xiàn)致細胞病變(Cytopathic effect,CPE)。Q-PCR檢測肺組織病毒載量。瑞氏染色后行支氣管肺泡灌洗液(Bronchoalvo larlavage fluid,BALF)中炎癥細胞及其分類計數(shù)。蘇木素-伊紅染色(hematoxylin and eosin,HE)后行肺組織病理評分;酶聯(lián)免疫吸附(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒檢測BALF中的細胞因子。結果:1.病毒定量結果顯示7型腺病毒拷貝數(shù)顯著高于3型腺病毒(p0.05);腺病毒生長曲線提示7型腺病毒在感染后24、36、60和72h病毒拷貝數(shù)明顯高于3型腺病毒和重組腺病毒Ad3/H7株(p0.05);3型腺病毒與7型腺病毒共培養(yǎng)結果提示在感染后12、24、36、48、72h,HAd V-7病毒復制明顯高于HAd V-3(p0.05)。2.細胞毒性結果顯示以低MOI感染A549細胞后,各時間點的細胞活性均無明顯差異;以高MOI感染A549細胞后,在感染后2、4h,3型腺病毒細胞活性比7型腺病毒、重組腺病毒Ad3/H7株細胞活性分別高26.5、42.6%和33、37.7%(P0.05,P0.01)。3.腺病毒激活補體實驗結果表明C3a產(chǎn)物增加在2分鐘時7型腺病毒與重組腺病毒Ad3/H7株、3型腺病毒有統(tǒng)計學意義。4.肺組織勻漿感染A549細胞后出現(xiàn)了較為明顯的CPE。3天時肺組織中7型腺病毒拷貝數(shù)明顯高于3型腺病毒(p0.05)。腺病毒感染BALB/c小鼠后引起的炎癥細胞類型以巨噬細胞和淋巴細胞為主;肺組織病理損傷以7型腺病毒感染最重,病理評分7型腺病毒較重組腺病毒Ad3/H7株和3型腺病毒升高(p0.05);。BALF中細胞因子TNF-a,IL-1β,IL-6和IFN-γ均有升高,以IL-1β升高最為顯著,7天最為明顯,7型腺病毒較重組腺病毒Ad3/H7株和3型腺病毒升高明顯(p0.05)。結論:7型腺病毒致病性強于3型腺病毒、重組腺病毒Ad3/H7株,提示不同血清型Ad V纖毛蛋白差異可能導致Ad V致病力的差異。第三部分3、7型腺病毒纖毛蛋白與其受體CD46、DSG-2結合介導其致病性差異的機制研究目的:第二部分研究結果表明3型腺病毒與7型腺病毒具有不同的纖毛蛋白,故具有不同的致病能力,但不同纖毛蛋白導致臨床病情輕重不同的具體機制尚不清楚。目前研究已經(jīng)證實B種腺病毒纖毛蛋白與其受體CD46、DSG-2結合觸發(fā)了感染,因此本部分探討是否3型腺病毒與7型腺病毒的纖毛蛋白與受體CD46、DSG-2結合導致了其后病情發(fā)展的不同。方法:1.收集3型腺病毒、7型腺病毒、重組腺病毒Ad3/H7株感染A549細胞后0.5、2小時的細胞爬片,通過激光共聚焦顯微鏡檢測病毒與受體結合表達以及水平。2.采用體外轉(zhuǎn)染CD46 si RNA、DSG-2 si RNA,通過Q-PCR法進行轉(zhuǎn)染后3、7型腺病毒定量以及ELISA方法檢測轉(zhuǎn)染后IL-8產(chǎn)物。結果:1.激光共聚焦顯微鏡觀察在腺病毒感染的早期,隨著時間的延長,7型腺病毒與其受體CD46、DSG-2進入細胞內(nèi)熒光明顯多于3型腺病毒和重組腺病毒Ad3/H7株。2.Q-PCR檢測結果表明,分別在使用CD46 si RNA后2、6、12以及24h,3型腺病毒拷貝數(shù)分別下降了5.8×104、7.9×104、16.6×104以及34.2×104;7型腺病毒拷貝數(shù)分別降低了15.2×107、19.6×107、24.8×107以及43.9×107;3型腺病毒與7型腺病毒拷貝數(shù)降低幅度為75.3%vs 65.8%;72.5%vs 69.3%;82.2%vs 67.6%;88.1%vs 74.2%;分別在DSG-2 si RNA后2、6、12以及24h,3型腺病毒拷貝數(shù)分別降低了6.7×104、6.6×104、12.1×104以及21.4×104;7型腺病毒拷貝數(shù)分別降低了4.5×107、13.4×107、21.7×107以及33.7×107;3型腺病毒與7型腺病毒拷貝數(shù)降低幅度為88.2%vs56.3%;75.9%vs 77.9%;86.4%vs 78.1%;87.7%vs 73.6%;在使用CD46si RNA后6、24h,3型腺病毒誘導的IL-8的分泌量(pg/ml)分別減少了98.8、187.5,7型腺病毒誘導的IL-8的分泌量(pg/ml)分別減少了144.4、366.6,3型腺病毒與7型腺病毒誘導的IL-8的分泌減少幅度分別為75.6%vs 73.7%;82.1%vs 84.3%;在使用DSG-2 si RNA后6、24h,3型腺病毒誘導的IL-8的分泌量(pg/ml)分別減少了69.9、136.5,7型腺病毒誘導的IL-8的分泌量(pg/ml)分別減少了105.2、186.1,3型腺病毒與7型腺病毒誘導的IL-8的分泌減少幅度分別為76.2%vs 77.9%;83.0%vs 83.3%;比較干擾前后7型腺病毒和3型腺病毒IL-8的產(chǎn)物下降量及減少幅度均無統(tǒng)計學差異。結論:病毒與受體結合免疫熒光以及受體基因沉默實驗提示不同血清型腺病毒的纖毛蛋白與其受體CD46、DSG-2結合導致了不同嚴重程度疾病的潛在機制,這些研究結果為理解不同腺病毒的毒力差異及為將來研制基于纖毛蛋白抗原表位的疫苗及抗腺病毒藥物提供了重要的理論依據(jù)。
【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R725.6
【圖文】：

圖 1. 1 重慶地區(qū)兒童腺病毒型別分布 1.1Adenoviruses types distribute in Children in Ch布病毒監(jiān)測結果顯示如圖 1.2，腺病毒感染分別出現(xiàn) 2 個小高峰，但是 2012、2013、2014 年，尤其是 2010、2011、2013、2014 年檢出明顯分別出現(xiàn)在 2010 年 8 月和 2014 年 6 月出現(xiàn)011 年 2 月和 8 月、2013 年 2 月和 2014 年 高的檢出率，且 2010、2011、2014 年夏季檢出年卻表現(xiàn)出相反的趨勢。夏季以 3 型為主，行，特別是在 2014 年夏季出現(xiàn)了以 3、7 型共

Figure 1.1Adenoviruses types distribute in Children in Chongqin份分布份腺病毒監(jiān)測結果顯示如圖 1.2，腺病毒感染分別在 20、8 月出現(xiàn) 2 個小高峰，但是 2012、2013、2014 年連續(xù) 高峰，尤其是 2010、2011、2013、2014 年檢出明顯超過高峰分別出現(xiàn)在 2010 年 8 月和 2014 年 6 月出現(xiàn)，而 7 在 2011 年 2 月和 8 月、2013 年 2 月和 2014 年 6 月。有較高的檢出率，且 2010、2011、2014 年夏季檢出率均連續(xù)兩年卻表現(xiàn)出相反的趨勢。夏季以 3 型為主，7 型峰流行，特別是在 2014 年夏季出現(xiàn)了以 3、7 型共同為

Ad3/H7 株（p＜0.05）。兩者共培養(yǎng)結果見圖 2.1.C，7 型腺病毒和 3 型腺病毒復制在感染后 0、2、8h 無明顯差別，然而，7 型腺病毒病毒復制能力在感染后 12、24、36、48、72h 明顯高于 3 型腺病毒。

【參考文獻】

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本文編號：2752681