【摘要】：第一部分人胎腦神經(jīng)干細(xì)胞發(fā)育規(guī)律及其克隆實(shí)驗(yàn)研究 目的：探討人胎腦發(fā)育中NSCs的分布、形態(tài)、生長(zhǎng)方式以及數(shù)量等特點(diǎn)，并對(duì)不同胎齡不同部位的腦組織在體外分別進(jìn)行NSCs培養(yǎng)，同時(shí)鑒定其增殖及分化潛能，最終探明胎腦發(fā)育中NSCs的變化規(guī)律，為進(jìn)一步在體內(nèi)外進(jìn)行調(diào)控NSCs的增殖分化機(jī)制研究以及臨床應(yīng)用NSCs治療神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病提供實(shí)驗(yàn)及理論依據(jù)。 方法：收集胎齡16～36w的自愿水囊引產(chǎn)胎兒90例作為研究對(duì)象，按胎齡16w，20w，24w，28w，32w，36w分成6組，每組15例；每例研究對(duì)象分別取海馬、紋狀體、室下區(qū)、額葉、顳葉、枕葉、頂葉等7個(gè)部位的腦組織作為實(shí)驗(yàn)材料。采用原位雜交、免疫組織化學(xué)以及光鏡技術(shù)分別對(duì)6組7個(gè)部位胎腦組織NSCs的分布、形態(tài)、生長(zhǎng)方式以及數(shù)量進(jìn)行檢測(cè)。采用包含bFGF及EGF的無血清培養(yǎng)基和單細(xì)胞克隆技術(shù)，分別從6組7個(gè)部位胎腦組織中分離出NSCs，并在體外進(jìn)行培養(yǎng)、傳代、分化，同時(shí)應(yīng)用免疫熒光染色技術(shù)對(duì)培養(yǎng)的NSCs及其分化的細(xì)胞進(jìn)行鑒定。 結(jié)果：6組7個(gè)部位胎腦組織均存在NSCs，NSCs包括大小圓形、大小橢圓形、梭形、星形、三角形、多角形等細(xì)胞形態(tài)。可觀察到兩兩對(duì)稱和不對(duì)稱分裂的NSCs、2-8個(gè)NSCs形成的集落、群狀、簇狀等NSCs生長(zhǎng)方式，群狀、簇狀分布的NSCs好似群狀遷移的NSCs群也好似NSCs發(fā)生中心，有的NSCs突起伸向別的細(xì)胞，形成突觸聯(lián)系。不同胎齡不同部位NSCs在分布部位、形態(tài)、生長(zhǎng)方式以及數(shù)量等方面存在一定差異。不同胎齡同一部位的NSCs數(shù)量隨著胎齡的增加而減少，同一胎齡 不同部位的NSCs數(shù)量自海馬、室下區(qū)、紋狀體、額葉、穎葉、頂葉以 及枕葉依次減少，且相互之間存在顯著性差異。星形NSCs呈Nestin和 CFAP雙表達(dá)。在28w胎齡組的海馬及室下區(qū)、32w和36w胎齡組的海 馬、室下區(qū)及紋狀體等部位均存在Nestin和CD34蛋白雙表達(dá)陽性NSCs。 在16w，20w，24W，28w和32w胎齡組的7個(gè)部位均存在Nestin和CD133 蛋白雙表達(dá)陽性NSCs。6組7個(gè)部位的腦組織在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí) 細(xì)胞呈懸浮狀態(tài)生長(zhǎng)，形成神經(jīng)球，該細(xì)胞具有連續(xù)克隆能力，可傳代 培養(yǎng)，表達(dá)神經(jīng)巢蛋白抗原;在含血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)NSCs可被誘導(dǎo) 分化，分化后的細(xì)胞分別表達(dá)神經(jīng)元細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì) 胞的特異性抗原。各胎齡組、各部位分別培養(yǎng)的NSCs在細(xì)胞形態(tài)、增 殖和多分化潛能方面無明顯差別。 結(jié)論:胎齡16~36w人胎腦海馬、室下區(qū)、紋狀體、額葉、顏葉、 頂葉等部位均存在NSCs。凍存細(xì)胞和水囊引產(chǎn)后48h內(nèi)分離的原代細(xì)胞 均能培養(yǎng)出NSCs，其原代NSCs與死亡時(shí)間呈負(fù)相關(guān);bFGF和EGF是 NSCs存活和增殖的關(guān)鍵生長(zhǎng)因子。Nestin和CD133是人胎腦NSCs的特 征性標(biāo)記物，CD34可能是人胎腦晚期NSCs的特征性標(biāo)記物。不同胎齡 同一部位人胎腦NSCs在分布部位、形態(tài)、生長(zhǎng)方式以及數(shù)量等方面存 在差異，同一胎齡不同部位人胎腦NSCs在分布部位、形態(tài)、生長(zhǎng)方式 以及數(shù)量等方面同樣存在差異。人胎腦室下區(qū)及海馬齒狀回是NSCs的 發(fā)源地，但人胎腦可能存在室下區(qū)及海馬齒狀回以外的NSCs生發(fā)中心。 人胎腦NSCs仍然是移植的重要材料來源。人胎腦在體NSCs的形態(tài)多樣 性與體外培養(yǎng)NSCs的形態(tài)單一性不一致的現(xiàn)象提示，在體調(diào)控自身 Nscs的增殖和分化可能是治療疾病另一條更有前景的道路。
【學(xué)位授予單位】：第一軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2004
【分類號(hào)】：R722.121
【圖文】：

部位圖34:6組人胎腦7個(gè)部位Nestin蛋白陽性NSCs檢出率比較六、6組7個(gè)部位胎腦組織免疫組化雙標(biāo)染色結(jié)果1.Nes血和GEAp蛋白雙標(biāo)染色結(jié)果通過對(duì)90例胎腦7個(gè)部位腦組織細(xì)胞進(jìn)行免疫組化雙標(biāo)染色，檢測(cè)和鑒定NSCs以及星形膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，研究對(duì)象的所有檢測(cè)部位均能檢測(cè)到表達(dá)兩種蛋白的3種細(xì)胞，即:單純表達(dá)Nestin的NSCS，同時(shí)表達(dá)Nestin和GFAP的NSCs，單純表達(dá)GFAp的星形膠質(zhì)細(xì)胞。各部位星形膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量較多，NSCs只在檢測(cè)部位的某區(qū)域呈散在、集落樣、簇狀以及群狀等生長(zhǎng)方式存在。神經(jīng)干細(xì)胞的形態(tài)呈多樣性，大小不一，并且隨部位、胎齡的不同存在較大的差異。Nestin和GFAP雙表達(dá)的NSCs主要呈星形，大小不一，并且從顏色的深淺看出，GFAP在其表達(dá)的不同NSCs中，也存在表達(dá)強(qiáng)度不同，同時(shí)，可看到GFAP雙表達(dá)NSCs的對(duì)稱分裂象，在其分布部位、形態(tài)、大小、生長(zhǎng)方式等方面與免疫組

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1 林玲;鄭志z

本文編號(hào)：2750149