【摘要】： 前言 新生兒肺出血是新生兒期常見危重癥之一，起病急，早期不易發(fā)現(xiàn)，自臨床應(yīng)用肺表面活性物質(zhì)替代療法以來，應(yīng)用表面活性物質(zhì)治療后仍死亡的早產(chǎn)兒中，其肺出血，尤其是肺泡內(nèi)出血的發(fā)生率仍較高。病死率高達40-50％。新生兒肺出血的病因很多，包括窒息，感染，動脈導(dǎo)管未閉，寒冷損傷，早產(chǎn)兒，多血癥，血液凝固異常等。但其病理生理機制仍不清楚。臨床研究結(jié)果顯示，新生兒彌漫性肺出血患兒肺泡壁內(nèi)的彈力纖維失去網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，血管基膜出現(xiàn)多處斷裂；對肺出血新生兒監(jiān)測肺動脈壓力，發(fā)現(xiàn)肺出血死亡患兒左室收縮功能降低。目前新生兒肺出血的高發(fā)人群主要包括早產(chǎn)兒，極低出生體重兒，宮內(nèi)發(fā)育遲緩(IUGR)患兒。并發(fā)現(xiàn)早產(chǎn)兒肺出血與早產(chǎn)兒動脈導(dǎo)管分流及肺內(nèi)血流量增多有關(guān)。近年來的基礎(chǔ)研究顯示，肺部毛細(xì)血管壓力衰竭是造成肺出血的原因之一。這種壓力衰竭可發(fā)生于肺部毛細(xì)血管基膜成分(Ⅳ型膠原)缺乏時，其結(jié)果可導(dǎo)致高通透性肺水腫或大面積肺出血。這種壓力衰竭的病理改變包括：肺毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞層，上皮細(xì)胞層，有時甚至毛細(xì)血管壁全層斷裂。這種病理改變與新生兒肺出血的病理改變基本一致，并且，早產(chǎn)兒肺組織較新生兒肺組織發(fā)育不成熟，新生兒肺組織又較成年人肺組織發(fā)育不成熟，這種肺組織血管發(fā)育的差異可能是新生兒，尤其是早產(chǎn)兒易發(fā)生肺出血的原因之一。但是，必須要證明肺出血時存在肺血管的損傷，由于肺毛細(xì)血管存在內(nèi)皮細(xì)胞和基膜的破壞，才使結(jié)構(gòu)發(fā)育薄弱的新生兒肺組織在一些病因的作用下，易發(fā)生肺出血。 目前，用內(nèi)毒素制備成年大鼠ARDS是已被公認(rèn)的經(jīng)典動物模型。感染也是新生兒發(fā)生肺出血的常見病因，但是，目前尚無研究新生兒肺出血發(fā) 病機制的動物模型。因此，我們嘗試用經(jīng)典的致成年大鼠All及ARDS的 LPS腹腔注射法來制備新生大鼠肺損傷和肺出血的動物模型，并與成年大 鼠對比，探討內(nèi)毒素?fù)p傷新生大鼠肺組織的病理特點及其發(fā)病機制。在成 人ARDS患者中，已有研究表明，成人彌漫性肺損傷存在肺血管基膜的損 傷，新生兒肺出血死亡患兒的病理也發(fā)現(xiàn)，肺毛細(xì)血管表現(xiàn)為基膜斷裂。 以上研究結(jié)果表明，血管基膜在肺出血的發(fā)病機制中起著重要的作用。 所以，給新生大鼠腹腔注射內(nèi)毒素，觀察其不同時間點肺組織的病理改變， 尤其電鏡下觀察LPS作用后，肺毛細(xì)血管基膜是否發(fā)生斷裂。血管基膜的 成分主要包括 IV型膠原和層粘連蛋白，采用 Western Blotting和原位雜交的 方法檢測基膜的成分＊型膠原和層粘連蛋白的含量及其 mRNA在肺組織 的表達改變，并與成年大鼠對比，探討新生大鼠易發(fā)生肺出血的原因。降解 w型膠原和層粘連蛋白的MMP系統(tǒng)中，采用免疫組化和RT－PCR的方法 檢測 MMP－2及其抑制物 TIMP－2的蛋白及其 InRNA在肺組織表達的變 化。調(diào)節(jié)MMP系統(tǒng)表達改變的主要因素是纖溶酶，而纖溶酶是在t－PA的 作用下由纖溶酶原轉(zhuǎn)變而來，所以，用RT－PCR的方法進一步研究t－PA 及其抑制物PAI則在肺組織中表達的改變，t－PA及其抑制物PAI一均 由血管內(nèi)皮細(xì)胞所分泌，同時檢測肺血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌PECAM一二的情 況，以證實肺血管內(nèi)皮細(xì)胞在新生大鼠肺出血的發(fā)病機制中起著重要的作 用，并說明是由于擁損傷了肺血管內(nèi)皮細(xì)胞，首先是內(nèi)皮細(xì)胞的功能和 形態(tài)的改變，造成了基膜的損傷和局部的高凝狀態(tài)，進而發(fā)生肺出血。以進 一步闡明e對新生大鼠肺組織的影響及其發(fā)病機制，為新生兒肺出血的 治療提供依據(jù)。 實驗材料與方法 一、動物模型 用LPS腹腔注射的方法制備新生大鼠動物（Wistar大鼠，日齡7天，體 重 12－189，共 88只）模型，劑量為 sing／km，致傷后大鼠隨機活動。將新生 大鼠隨機分為 8組，生理鹽水對照組（A廣 LPS注射后 30m組p入 lh組 （C），Zh組（D），4h組（E），sh組r）以上各組 n＝8，16h組＊組，n二 16）， 24h組出組，n＝24），其中 16h組＊）死亡 8只，24h組出）死亡 17只。所 ·2· 有存活動物按設(shè)定時間斷頭處死，立即打開胸腔，取右肺上葉留作提取 RNA用，右肺其余肺葉作光鏡及電鏡病理檢查。成年大鼠隨機分為7組， 對照組和LPS給藥組，于相同時間點處死（無24小時組人每個時間點8 只。 二、標(biāo)本采集和處理 各組大鼠分別于設(shè)定的時間點用 5％戊巴比妥鈉 20mg／kg腹腔麻醉 后，立即打開胸腹腔，觀察各臟器的改變，并取肺組織，按以下方式分別保 存： 1．于無菌條件下取材，取右肺上葉置于無Rnase的Eppendorf管中于 液氮和一70℃冰箱中保存。 2·取右肺下葉置于 0．二％DEPC的 4％多聚甲醛①．IMPBS，pH7．0－ 7．6）固定，24小時內(nèi)常規(guī)脫水及石蠟包埋。 3．取 lrnm’肺組織，2．5％戊．二醛中固定。 三、實驗方法 1．病理改變觀察 問）大體觀察：按照文獻方法將肺出血分為5級：I級正常肺；11級肺 水腫
【學(xué)位授予單位】：中國醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2003
【分類號】：R722.1
【圖文】：

LpS注射后新生和成年大鼠肺組織Co1W蛋白表達的em雜交法檢測肺組織層粘連蛋白(LN)表達的改，新生大鼠肺內(nèi)層粘連蛋白的表達逐漸減少，于<0.01)，4一8小時差異顯著，8小時降至最低。型膠原早，LPS后2小時即有顯著差異。與成，LP，

LPS注射后時間.3廿S注射后新生和成年大鼠肺組織LN蛋白表達的改雜交法檢測肺血管基膜W型膠原和層粘連蛋白m光鏡下可見，W型膠原和層粘連蛋白mRNA在新在血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)，對照組肺組織W型膠原和

Groupeontro{ColwmRNALNmRNA91.72士2.3196.58士1.630.sh1h90.85士2.2195.66士1.7988.89士1.66申93.95土2.0387.93土2.32申93.21土1.24.85.38士1.96.90.25士1.73.00UOLn，n八石486.32士1.75中92.95士1.56.87.21士2.1493.04士1.65中24h88.64士1.09*93.18土1.39中與eontrol組比較，’P<0.05，’‘P<0.01

【參考文獻】

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本文編號：2750171