【摘要】： 新生兒缺血缺氧性腦損傷(hypoxic-ischemic brain damage HIBD)是造成兒童神經(jīng)系統(tǒng)傷殘的主要原因之一,病理學(xué)證實(shí)其主要病變是少突膠質(zhì)細(xì)胞尤其是少突膠質(zhì)前體細(xì)胞以及髓鞘的病變而引起的腦白質(zhì)損傷。Neuregulin 1(NRG1)是一種細(xì)胞間信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白,在腦組織內(nèi)由神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元產(chǎn)生。它能促進(jìn)少突膠質(zhì)細(xì)胞存活、遷移、增殖和分化,也可以促進(jìn)髓鞘形成。NRG1在缺氧誘導(dǎo)的少突膠質(zhì)前體細(xì)胞損傷中是否有保護(hù)作用?是否能促進(jìn)因缺氧而引起的腦白質(zhì)損傷的修復(fù)?為了探討這些問題,本實(shí)驗(yàn)通過體外體內(nèi)兩部分四個(gè)分題進(jìn)行研究。 論文1:少突膠質(zhì)細(xì)胞原代純化培養(yǎng)及細(xì)胞體外缺氧模型建立 目的純化培養(yǎng)大鼠大腦皮層O2A細(xì)胞,觀察其形態(tài),并研究不同培養(yǎng)條件對其生長和分化的影響;以及建立體外O2A細(xì)胞缺氧培養(yǎng)模型。 方法采用兩次恒溫?fù)u床振蕩培養(yǎng)法,倒置顯微鏡結(jié)合免疫熒光染色法鑒定細(xì)胞種類并判斷純度,缺氧聯(lián)合低糖培養(yǎng)建立細(xì)胞體外缺氧模型,透射電鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu),臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)細(xì)胞存活率,流式細(xì)胞儀定量分析細(xì)胞凋亡情況。 結(jié)果O2A祖細(xì)胞胞體呈圓形,常有單極或雙極突起,形成克隆球,A2B5標(biāo)記陽性,免疫熒光鑒定細(xì)胞純度可達(dá)90%以上。生長因子PDGF和bFGF對O2A細(xì)胞的存活和增殖及其重要。O2A細(xì)胞具有雙向分化的能力,在不同誘導(dǎo)條件下可分化為星型膠質(zhì)細(xì)胞或少突膠質(zhì)細(xì)胞。電鏡觀察O2A祖細(xì)胞呈圓形或橢圓形,核仁可見,胞漿內(nèi)細(xì)胞器少,核周見成束胞質(zhì)絲。缺氧培養(yǎng)3h細(xì)胞變化不明顯,但缺氧培養(yǎng)6h,細(xì)胞存活率明顯下降(P0.01),凋亡細(xì)胞明顯增多(P0.01),并且隨著缺氧時(shí)間延長存活細(xì)胞更少,凋亡細(xì)胞更多,至缺氧培養(yǎng)12h,大多數(shù)細(xì)胞破碎。 結(jié)論1.選擇合適的培養(yǎng)基對O2A細(xì)胞純化培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化極其重要。 2.低糖聯(lián)合缺氧培養(yǎng)模式可以建立可行的O2A細(xì)胞體外缺氧模型。 論文2: NRGβ1對缺氧培養(yǎng)O2A細(xì)胞保護(hù)作用及PI3K-Akt信號通路在其中的調(diào)控作用 目的研究NRGβ1對缺氧培養(yǎng)O2A細(xì)胞損傷的保護(hù)作用,并探討其主要的細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。 方法原代純化的O2A細(xì)胞分為缺氧聯(lián)合低糖培養(yǎng)組和NRGβ1干預(yù)組,NRGβ1干預(yù)組指在缺氧培養(yǎng)之前在培養(yǎng)液中加入兩種濃度的NRGβ1。臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)細(xì)胞存活率,Hoechest33258染色和流式細(xì)胞儀觀測細(xì)胞凋亡情況,western blot法測定Akt和p-Akt蛋白的表達(dá)并定量分析。 結(jié)果NRGβ1干預(yù)組O2A細(xì)胞存活率高于缺氧培養(yǎng)組(P0.05或P0.01),且凋亡的O2A細(xì)胞減少(P0.05或P0.01),NRGβ1對細(xì)胞的保護(hù)呈劑量依賴性。NRGβ1可以上調(diào)因缺氧培養(yǎng)而降低的p-Akt的表達(dá),但該作用被Ly294002所阻斷。 結(jié)論NRGβ1對缺氧培養(yǎng)的O2A細(xì)胞有保護(hù)作用,且該作用可能與PI3K依賴的p-Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活有關(guān)。 論文3. 3日齡新生鼠腦白質(zhì)損傷模型建立及超微病理學(xué)研究 目的建立新生鼠腦白質(zhì)損傷的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?并研究其膠質(zhì)細(xì)胞和髓鞘的超微結(jié)構(gòu)變化。 方法80只3日齡(P3)SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(sham)和缺血缺氧(HI)組,每組各40只。sham組僅分離右側(cè)頸總動(dòng)脈,HI組行右側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎術(shù),術(shù)后吸6%氧氣-94%氮?dú)饣旌蠚怏w3h,建立P3大鼠缺血缺氧模型。觀察兩組大鼠(每組n=20)生理和神經(jīng)學(xué)行為包括體重變化,睜眼時(shí)間,懸崖逃避能力,雙臂懸吊能力。取P14,P21大鼠腦組織各10只進(jìn)行常規(guī)病理HE染色,免疫組化染色以及電鏡觀察膠質(zhì)細(xì)胞和髓鞘的變化。 結(jié)果HI組大鼠生長緩慢,睜眼時(shí)間延遲,懸崖逃避能力及雙臂懸吊能力均發(fā)育緩慢,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。HE染色見60%(6/10)P14及50% (5/10) P21大鼠腦室周圍白質(zhì)及(或)胼胝體纖維排列紊亂,疏松。MBP免疫組化染色發(fā)現(xiàn)HI組頸動(dòng)脈結(jié)扎側(cè)腦組織MBP表達(dá)減少,電鏡觀察見HI組少突膠質(zhì)細(xì)胞可同時(shí)出現(xiàn)凋亡和腫脹性死亡兩種改變,髓鞘呈蟲蝕樣改變,髓鞘厚度變薄(P0.05)。結(jié)論P(yáng)3大鼠單側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎聯(lián)合低氧實(shí)驗(yàn)可以建立腦白質(zhì)損傷的動(dòng)物模型。少突膠質(zhì)細(xì)胞可發(fā)生凋亡和脹亡兩種病變,髓鞘合成減少和異常合成可能并存。 論文4: NRGβ1對腦白質(zhì)損傷模型新生鼠的保護(hù)作用 目的:探討NRGβ1對新生鼠腦白質(zhì)損傷的保護(hù)作用。 方法: P3大鼠隨機(jī)分成假手術(shù)組(sham, n=40),缺氧缺血組(HI, n=40),和NRGβ1治療組(NRGβ1,n=40)。sham組僅分離右側(cè)頸總動(dòng)脈;HI組行右側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎術(shù),恢復(fù)1～1.5h后腦室內(nèi)注射2ul無菌生理鹽水再放置于含6%氧氣-94%氮?dú)饣旌蠚怏w的容器中3h;NRGβ1組行右側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎術(shù),恢復(fù)1～1.5h后腦室內(nèi)注射2ul無菌NRGβ1后再放置于含6%氧氣-94%氮?dú)饣旌蠚怏w的容器中3h。觀察各組大鼠生長發(fā)育和神經(jīng)學(xué)行為變化(n=20)包括體重變化,睜眼時(shí)間,懸崖回避反應(yīng)時(shí)間,雙臂懸掛時(shí)間。取各組P7,P14和P21大鼠腦室周圍白質(zhì)(n=5,每個(gè)日齡),應(yīng)用Western blot法比較分析各組大鼠腦室周圍白質(zhì)髓鞘堿性蛋白(MBP)合成情況。取各組P21大鼠(n=5)腦室周圍白質(zhì)和胼胝體組織常規(guī)電鏡標(biāo)本處理后透射電鏡觀察膠質(zhì)細(xì)胞和髓鞘的變化。 結(jié)果:NRGβ1組大鼠腦室周圍白質(zhì)中少突膠質(zhì)細(xì)胞病變與HI組相比較有所減輕,腫脹性死亡和凋亡的少突膠質(zhì)細(xì)胞減少,胼胝體超微結(jié)構(gòu)觀察髓鞘病變減輕,髓鞘厚度定量分析發(fā)現(xiàn)髓鞘的厚度也有所增厚(P0.05)。Western blot檢測P7、P14、P21大鼠腦室周圍白質(zhì)MBP表達(dá)發(fā)現(xiàn)各組大鼠隨著生長,MBP表達(dá)逐步增加。與sham組相比,HI組相應(yīng)日齡大鼠腦白質(zhì)MBP的表達(dá)明顯減少(P0.01),而NRGβ1組相應(yīng)日齡者M(jìn)BP的表達(dá)與sham組相比均有恢復(fù)(P0.05)。生理發(fā)育和神經(jīng)行為觀察發(fā)現(xiàn)與HI組比較,NRGβ1組大鼠生長發(fā)育得以改善(體重增加,睜眼時(shí)間提早),懸崖回避反應(yīng)時(shí)間也縮短(P0.05),但雙臂懸掛能力無明顯改善。 結(jié)論:NRGβ1可以減輕HI引起的少突膠質(zhì)細(xì)胞的病變,促進(jìn)髓鞘合成,并使大鼠部分神經(jīng)行為功能得以不同程度恢復(fù)。
【學(xué)位授予單位】：福建醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號】：R722.1
【圖文】：

混合培養(yǎng)膠質(zhì)細(xì)胞，分二層，底層細(xì)胞體積大，扁平長滿瓶底，小圓形強(qiáng)折光性細(xì)胞位于七層，常成堆生長

上層細(xì)胞純化培養(yǎng)3d，細(xì)胞小，有強(qiáng)折光性，常有單極或雙極突起xlno

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1 周琳瑛;NRGβ1對少突膠質(zhì)前體細(xì)胞保護(hù)作用及在新生鼠腦缺氧性損傷中應(yīng)用的探討[D];福建醫(yī)科大學(xué);2008年

2 殷紅兵;細(xì)胞移植治療多發(fā)性硬化的實(shí)驗(yàn)研究[D];中國人民解放軍軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院;2005年

本文編號：2742275