【摘要】：目的: 1.化學(xué)合成NgR特異性小干擾RNA(siRNA),觀察siRNA對具有神經(jīng)元分化潛能的克隆細(xì)胞系PC12細(xì)胞的NgR mRNA和蛋白表達(dá)的影響。 2.探討NgR特異性siRNA活體動物應(yīng)用的效果,觀察NgR沉默對新生大鼠缺氧缺血性腦損傷后神經(jīng)軸突再生和功能的影響,為進(jìn)一步應(yīng)用載體長效表達(dá)siRNA治療新生兒缺氧缺血性腦病提供理論依據(jù)。 方法: 1.培養(yǎng)大鼠腎上腺嗜鉻瘤細(xì)胞PC12細(xì)胞,用神經(jīng)生長因子(NGF)誘導(dǎo)使其分化為類神經(jīng)細(xì)胞,化學(xué)合成大鼠NgR特異性siRNA,使之轉(zhuǎn)染PC12細(xì)胞,采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR及Western blot檢測NgR基因及蛋白的表達(dá),以檢測干擾的效率。 2.60只SD新生大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型(HIBD)組、NS+轉(zhuǎn)染試劑對照組、siNgR+轉(zhuǎn)染試劑治療組,結(jié)扎新生6天大鼠左側(cè)頸總動脈合并缺氧建立HIBD模型,腦室內(nèi)注射siNgR/NS+轉(zhuǎn)染試劑,新生大鼠造模72h后連續(xù)3天側(cè)腦室注射給藥,用藥3天后檢測腦組織中NgR mRNA及蛋白的表達(dá);用藥2周后進(jìn)行水迷宮實(shí)驗(yàn),并檢測腦組織GAP-43的表達(dá),觀察神經(jīng)再生情況。 結(jié)果: 1.NgR特異性siRNA可以實(shí)現(xiàn)大鼠PC12細(xì)胞內(nèi)源性NgR基因沉默,實(shí)時(shí)熒光定量PCR及Western blot結(jié)果顯示,NgR mRNA及蛋白與對照組比較表達(dá)均降低,且差異具有顯著性(P0.05)。 2.結(jié)扎P6新生SD大鼠左側(cè)頸總動脈合并缺氧建立新生大鼠缺氧缺血性腦白質(zhì)損傷模型,造模后連續(xù)3天腦室內(nèi)注射NgR siRNA(30mnol)+轉(zhuǎn)染試劑,處理后72hRT-PRC凝膠電泳結(jié)果顯示,NgR條帶消失,而鹽水+轉(zhuǎn)染試劑對照組NgR條帶清晰可見,而兩組管家基因GAPHD條帶清晰;且免疫組化顯示NgR siRNA治療組NgR蛋白表達(dá)減少。 3.用藥21天后進(jìn)行水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測大鼠平均逃生時(shí)間,結(jié)果顯示顯示治siNgR治療組較HIBD組逃生時(shí)間縮短,差異具有顯著性(P0.05);而與假手術(shù)組比較無顯著性差異。(P0.05)。 4.免疫組化檢測腦組織GAP43蛋白表達(dá),結(jié)果顯示siNgR治療組較HIBD組蛋白表達(dá)增多,且差異有顯著性(P0.05),而與假手術(shù)組比較無顯著性差異(P0.05)。 結(jié)論: 我們在細(xì)胞水平的實(shí)驗(yàn)證實(shí):化學(xué)合成的NgR特異性siRNA能夠抑制大鼠PC12細(xì)胞NgR mRNA和蛋白的表達(dá);在新生大鼠HIBD動物模型中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí):轉(zhuǎn)染NgR特異的siRNA能夠干擾大鼠NgR mRNA和蛋白表達(dá)水平,在一定程度上促進(jìn)大鼠神經(jīng)功能的恢復(fù)和神經(jīng)纖維再生,是HIE后藥物治療可能的選擇之一。NgR特異siRNA促進(jìn)新生大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)可能的作用機(jī)制是:通過特異性下調(diào)NgR表達(dá),阻斷其與配體(Nogo、MAG、Omgp)的結(jié)合,從而對抗三種髓磷脂相關(guān)抑制物的軸突再生抑制作用,為中樞神經(jīng)軸突再生提供良好的環(huán)境而獲得。
【學(xué)位授予單位】：廣州醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R722.1
【圖文】：

3.2 轉(zhuǎn)染效果的觀察按照說明書的步驟，將含有綠色熒光標(biāo)記的陰性序列 siRNA 的轉(zhuǎn)染反應(yīng)液與PC12 細(xì)胞閉光共孵育 6h 后，棄去轉(zhuǎn)染反應(yīng)液，用 PBS 洗 1-2 遍，把沒有轉(zhuǎn)染進(jìn)去而殘留在培養(yǎng)基或附在表面的熒光標(biāo)記 siRNA 洗掉。注意洗滌時(shí)小心，不要使細(xì)胞洗脫落，檢測時(shí)先使光路先對準(zhǔn)未轉(zhuǎn)染熒光標(biāo)記 siRNA 的孔，調(diào)好焦距后轉(zhuǎn)向?qū)?zhǔn)轉(zhuǎn)染孔，打開激發(fā)光后馬上觀察拍照，并在同一視野中拍下明場的細(xì)胞照片。可見細(xì)胞發(fā)出綠色的熒光，無細(xì)胞區(qū)域則無熒光，表明綠色熒光標(biāo)記的陰性序列 siRNA已成功轉(zhuǎn)染進(jìn)入 PC12 細(xì)胞（圖 2A-B）。圖1A：未經(jīng)NGF誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞形態(tài) (10×10）圖 1B：NGF 誘導(dǎo)培養(yǎng) 24hPC12 細(xì)胞形態(tài) (10×10）

3.2 轉(zhuǎn)染效果的觀察按照說明書的步驟，將含有綠色熒光標(biāo)記的陰性序列 siRNA 的轉(zhuǎn)染反應(yīng)液與PC12 細(xì)胞閉光共孵育 6h 后，棄去轉(zhuǎn)染反應(yīng)液，用 PBS 洗 1-2 遍，把沒有轉(zhuǎn)染進(jìn)去而殘留在培養(yǎng)基或附在表面的熒光標(biāo)記 siRNA 洗掉。注意洗滌時(shí)小心，不要使細(xì)胞洗脫落，檢測時(shí)先使光路先對準(zhǔn)未轉(zhuǎn)染熒光標(biāo)記 siRNA 的孔，調(diào)好焦距后轉(zhuǎn)向?qū)?zhǔn)轉(zhuǎn)染孔，打開激發(fā)光后馬上觀察拍照，并在同一視野中拍下明場的細(xì)胞照片。可見細(xì)胞發(fā)出綠色的熒光，無細(xì)胞區(qū)域則無熒光，表明綠色熒光標(biāo)記的陰性序列 siRNA已成功轉(zhuǎn)染進(jìn)入 PC12 細(xì)胞（圖 2A-B）。圖1A：未經(jīng)NGF誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞形態(tài) (10×10）圖 1B：NGF 誘導(dǎo)培養(yǎng) 24hPC12 細(xì)胞形態(tài) (10×10）

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2740049