【摘要】：第一部分腸道病毒71型感染人Jurkat細胞模型的建立目的建立腸道病毒71型(Enterovirus 71,EV71)體外感染人Jurkat細胞模型。方法EV71毒株由廣西疾病預防控制中心于2008年從手足口病患者糞便中分離獲得并保存。EV71病毒以感染復數(shù)(Multiplicity of infection,MOI)=5的條件感染生長旺盛的Jurkat細胞,同時設立正常對照組,每天在倒置顯微鏡下觀察并記錄病毒致細胞病變效應(Cytopathic effect,CPE),并于感染24小時后收集細胞,采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(Reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)和懸浮細胞免疫熒光染色方法驗證EV71能否感染人Jurkat細胞。結果1.RT-PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結果顯示,EV71感染人Jurkat細胞的擴增條帶與陽性對照EV71感染橫紋肌肉瘤細胞(Rhabdomyosarcoma cells,RD)的目的條帶位置相符;陰性對照未感染EV71人Jurkat細胞則未見條帶。RT-PCR結果證實EV71可感染人Jurkat細胞。2.懸浮細胞免疫熒光染色結果顯示,EV71抗原可與EV71特異性單克隆抗體結合,在熒光顯微鏡下可觀察到EV71感染的Jurkat細胞EV7l免疫反應陽性,陽性細胞的胞體為綠色熒光,并覆蓋胞核;陰性對照未感染EV71 人Jurkat細胞則未見染色。免疫熒光染色結果證實EV71可感染Jurkat細胞。3.倒置顯微鏡下觀察EV71感染人Jurkat細胞可引起CPE反應,細胞體積增大,呈氣球樣改變,胞核腫脹,胞漿呈顆粒樣變化,胞膜邊緣不整齊,細胞逐漸破碎死亡;正常對照組細胞則未見CPE反應。結論成功建立EV71體外感染人Jurkat細胞模型,為進一步的發(fā)病機制的研究奠定基礎。第二部分腸道病毒71型感染人Jurkat細胞模型對γ-干擾素分泌的影響目的在分子水平和蛋白水平上探討EV71感染對人Jurkat細胞γ-干擾素(Interferon-γ,IFN-γ)分泌的影響。方法EV71病毒以MOI=5的條件感染Jurkat細胞,同時設立正常對照37℃培養(yǎng),收集感染6小時、24小時、48小時和72小時的感染組和正常對照組細胞和細胞培養(yǎng)上清。Trizol法提取細胞總RNA,逆轉(zhuǎn)錄合成c DNA,以目的基因IFN-γ和內(nèi)參基因甘油醛-3-磷酸脫氫酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)作為模板進行實時熒光定量聚合酶鏈式反應(Quantitative Real-time polymerase chain reaction,Real-time PCR)。根據(jù)目的基因IFN-γ和內(nèi)參基因GAPDH的Ct值,采用相對定量2-ΔΔCt方法計算IFN-γ的m RNA相對表達量,Fold Change為感染組相對未感染組基因的相對表達倍數(shù)。采用酶聯(lián)免疫吸附測定(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)檢測細胞培養(yǎng)上清中細胞因子IFN-γ的分泌水平。采用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計學分析,各組IFN-γ的分泌水平之間的差異是否有統(tǒng)計學意義。結果1.Real-time PCR檢測結果顯示,72小時感染組IFN-γ的m RNA相對表達量為2.62±0.79,與48小時感染組之間比較差異無統(tǒng)計學意義(P0.05),高于24小時感染組(P0.05),明顯高于6小時感染組和正常對照組(P0.01);48小時感染組IFN-γ的m RNA相對表達量為2.37±0.87,與24小時感染組之間比較差異無統(tǒng)計學意義(P0.05),明顯高于6小時感染組和正常對照組(P0.01);24小時感染組(1.48±0.77)、6小時感染組(0.96±0.19)和正常對照組(1.00±0.00)IFN-γ的m RNA相對表達量之間比較差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。2.ELISA檢測結果顯示,在感染EV71的Jurkat細胞與未感染EV71的Jurkat細胞中IFN-γ均僅有極低量表達,正常對照組、6小時感染組、24小時感染組、48小時感染組和72小時感染組IFN-γ的分泌水平之間比較差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。結論1.在分子水平上,EV71感染可引起人Jurkat細胞中IFN-γm RNA的表達水平升高,其升高水平與感染時間相關。2.在蛋白水平上,EV71感染人Jurkat細胞中細胞因子IFN-γ無明顯表達。
【學位授予單位】：廣西醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R725.1
【圖文】：

和瓊脂糖凝膠電泳驗證 EV71 能否感染人 Jurk證 EV71 能否感染人 Jurkat 細胞，我們使用 EV71 Jurkat 細胞，同時設立陽性對照（RD 細胞）和陰時后收集細胞，用 Trizol 法提取細胞總 RNA，以進行 PCR 檢測。結果如圖 1-1 所示，第 1 泳道是的 RD 細胞，可見 934bp 的目的條帶；第 2 泳道胞，可見擴增條帶與陽性對照目的條帶位置相符照的未感染 EV71 的 Jurkat 細胞。EV71 感染人 性對照 EV71 感染 RD 細胞的目的條帶位置相符Jurkat 細胞則未見條帶。RT-PCR 結果證實 EV71

圖 1-2 懸浮細胞免疫熒光染色驗證 EV71 能否感染圖-EV71：為 EV71 感染的 Jurkat 細胞；圖-DAPI-1：為 DAPI 圖-Merged：為圖-EV71 和圖-DAPI-1 的疊加；圖-Mock：為未圖-DAPI-2：為 DAPI 染色的未感染 EV71 Fig.1-2 EV71-infected Jurkat cells demonstrated using suspstaining(400×)[Detection of EV71 antigen in EV71-infected mmunofluorescence staining.Jurkat cells were incubated with EV7

【參考文獻】

相關期刊論文 前8條

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本文編號：2734034