【摘要】：目的:研究去泛素化酶USP4通過(guò)RLR信號(hào)通路調(diào)控腸道病毒71型感染的機(jī)制和功能,深入了解EV71感染及其逃逸免疫防御關(guān)系,為臨床治療EV71感染提供新的理論依據(jù)。方法:利用PCR芯片技術(shù)篩選去泛素化酶在EV71感染橫紋肌肉瘤細(xì)胞(RD)后的表達(dá)差異;EV71感染AG129小鼠收集左后腿肌肉組織,RT-PCR檢測(cè)病毒載量和USP4 m RNA的表達(dá)情況;去泛素化酶USP4表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染RD細(xì)胞,RT-PCR和Western blot檢測(cè)EV71病毒的復(fù)制情況,同時(shí)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡;Western blot檢測(cè)EV71感染RD細(xì)胞后IRF3和NF-κB p65蛋白及其磷酸化水平;poly(I:C)激活RLR信號(hào)通路,si RNA干擾或質(zhì)粒轉(zhuǎn)染去泛素化酶USP4時(shí)檢測(cè)NF-κB熒光素酶報(bào)告基因活性;免疫共沉淀檢測(cè)去泛素化酶USP4與TRAF6之間的結(jié)合作用,共轉(zhuǎn)染USP4、TRAF6和Ub檢測(cè)去泛素化酶USP4對(duì)TRAF6的功能研究;構(gòu)建EV71非結(jié)構(gòu)蛋白2A和3C質(zhì)粒,探討USP4降解機(jī)制;加入MG132、Q-VD和STS,進(jìn)一步研究2A蛋白酶切割USP4的機(jī)制。結(jié)果:去泛素化酶USP4在EV71感染過(guò)程中表達(dá)下調(diào),而EV71感染小鼠后USP4m RNA的表達(dá)也受到抑制。去泛素化酶USP4的高表達(dá)可抑制EV71增殖并且減少細(xì)胞凋亡。EV71的感染抑細(xì)胞中IRF3和NF-κB p65的磷酸化。USP4正性調(diào)控RLR誘導(dǎo)的NF-κB信號(hào)通路,對(duì)IFN信號(hào)通路沒(méi)有明顯變化;TRAF6是RLR抗病毒信號(hào)通路中激活NF-κB的關(guān)鍵蛋白,而去泛素化酶USP4通過(guò)對(duì)TRAF6分子K48去泛素化抑制其降解,從而激活下游炎癥因子的表達(dá),發(fā)揮抗病毒作用。另外,EV71中的非結(jié)構(gòu)蛋白2A可通過(guò)剪切USP4蛋白而降低該蛋白功能;STS誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡不會(huì)出現(xiàn)USP4的切割;MG132和Q-VD抑制后,2A蛋白酶依然切割USP4。結(jié)論:去泛素化酶USP4在RLR抗病毒信號(hào)通路中起到正性調(diào)控的作用;EV71感染宿主細(xì)胞后利用非結(jié)構(gòu)蛋白2A剪切USP4蛋白,促進(jìn)TRAF6蛋白通過(guò)蛋白酶體的降解,以達(dá)到抑制宿主細(xì)胞的免疫應(yīng)答,維持病毒自身增殖,從而達(dá)到逃逸宿主免疫防御作用。
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R725.1
【圖文】：

23圖 1 去泛素化酶 USP4 在 EV71 感染過(guò)程中表達(dá)下調(diào)（A）EV71 感染 RD 細(xì)胞后 8 h，收集細(xì)胞并提取 RNA，反轉(zhuǎn)后，做 PCR 基因芯片，圖中所列為幾個(gè)去泛素化酶變化明顯的結(jié)果。誤差線（平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差） （B） RT-PCR 分析 EV71 感染AG129 小鼠后，小鼠左下肢肌肉組織中 VP1 基因的表達(dá)情況。（C） RT-PCR 分析 EV71 感染AG129 小鼠后，小鼠左下肢肌肉組織中 USP4 基因的表達(dá)情況。（D）EV71 感染 RD 細(xì)胞后收集個(gè)小時(shí)點(diǎn) RNA, RT-PCR 檢測(cè) USP4 基因的表達(dá)情況 （E） EV71 感染 RD 細(xì)胞后收集個(gè)小時(shí)點(diǎn)蛋白，Western blot 檢測(cè) USP4 蛋白的表達(dá)情況 （F） Western blot 分析 EV71 感染 AG129 小鼠后，小鼠左下肢肌肉組織中 USP4 及 VP1 蛋白的表達(dá)情況。（“*”表示 P<0.05, “**”, 表示 P<0.01,“*** ” 表示 P<0.001）

25圖 2 去泛素化酶 USP4 參與細(xì)胞中抗 EV71 感染天然免疫反應(yīng)（A）空載質(zhì)粒為對(duì)照組，HA-USP4 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至 RD 細(xì)胞 48 h 后， 加入 EV71 病毒（MOI=0.5），12 h 光鏡下觀察拍照。 （B） 空載質(zhì)粒為對(duì)照組 HA-USP4 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至 RD 細(xì)胞 48 h 后，加入EV71 病毒（MOI=0.5），12 h 收集細(xì)胞上機(jī)流式檢測(cè)凋亡。（C） 和（D）空載質(zhì)粒為對(duì)照組，HA-USP4 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至 RD 細(xì)胞 48 h 后，加入 EV71 病毒（MOI=0.5），收集 0 h、8 h、12 h 和 24h 細(xì)胞提 RNA，RT-PCR 檢測(cè) USP4 和 EV71/VP1 的表達(dá)。 （E） 空載質(zhì)粒為對(duì)照組，HA-USP4質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至 RD 細(xì)胞 48 h 后，加入 EV71 病毒（MOI=0.5） ，收集 0 h、8 h、12 h 和 24 h 細(xì)胞提蛋白，Western blot 檢測(cè) USP4（HA）、VP1 和 GAPDH。（F）RD 細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染 HA-USP4 和對(duì)照組空載 48 h 后，EV71 病毒（MOI=0.5）感染細(xì)胞，然后收集細(xì)胞和上清，運(yùn)用空斑實(shí)驗(yàn)檢測(cè)病毒滴度。（“*”表示 P<0.05, “**”, 表示 P<0.01, “*** ” 表示 P<0.001）

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 陳姝樾;劉龍丁;;腸道病毒71型結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白的分子生物學(xué)特性[J];國(guó)際生物制品學(xué)雜志;2014年04期

本文編號(hào)：2727471