發(fā)布時間：2020-06-22 07:38

【摘要】：第一部分小檗堿對Jurkat細(xì)胞增殖、凋亡的影響及其分子機制的研究 目的 小檗堿(berberine, BBR)又名黃連素,近年來的藥理學(xué)研究顯示出其具有良好的抗腫瘤作用。我們先前的研究表明,小檗堿可協(xié)同TRAIL誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡,且其分子機制可能涉及抑制NF-κB/P65表達和caspase3, caspase8剪切活化。但是尚不清楚其他基因如P53或者MDM2是否參與小檗堿的這種作用。而Survivin是近年來研究較為熱門的凋亡抑制蛋白家族成員之一,具有抑制凋亡、調(diào)節(jié)分化的雙向作用,在正常的人體組織細(xì)胞幾乎不表達。近年來又發(fā)現(xiàn)survivin的異構(gòu)體survivin-2B和survivin-△Ex3對于癌癥發(fā)生和發(fā)展中的生物學(xué)功能和作用與survivin并不一致。而survivin及異構(gòu)體與MDM2、P53之間的相互作用機制也不清楚。因此本研究的目的： 1、小檗堿對Jurkat細(xì)胞的增殖、凋亡的影響及其分子生物學(xué)機制； 2、小檗堿對Jurkat細(xì)胞的作用機制是否不同于傳統(tǒng)化療藥物柔紅霉素。 方法 培養(yǎng)Jurkat細(xì)胞分為(1)空白對照組；(2)小檗堿組(25μM、50μM、100μM); (3)柔紅霉素對照組(0.1mg/L, lmg/L,10 mg/L);分別培養(yǎng)12、24h后取樣本用于后續(xù)實驗。利用CCK-8法檢測小檗堿及柔紅霉素對每組Jurkat細(xì)胞的生長抑制率；同時采用流式細(xì)胞術(shù)AnnexinV/PI染色法檢測其誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞凋亡的影響。用Real-time PCR及Western-blot方法檢測小檗堿及柔紅霉素作用Jurkat細(xì)胞后Survivin及其異構(gòu)體Survivin-2B和Survivin.△Ex3與MDM2、P53基因表達mRNA與蛋白的變化. 結(jié)果 1、小檗堿具有明顯抑制Jurkat細(xì)胞增殖并促進其凋亡的作用,其作用具有濃度依賴性與時間依賴性,呈現(xiàn)出隨濃度增加和作用時間延長表現(xiàn)出明顯增加的抑制率和凋亡率,與柔紅霉素作用Jurkat細(xì)胞所表現(xiàn)的的趨勢一致。 2、小檗堿抑制Survivin及其異構(gòu)體Survivin-△Ex3的表達,促進Survivin-2B表達,具有時間依賴性和濃度依賴性,柔紅霉素也表現(xiàn)出時間依賴性與濃度依賴性；但是二者的作用并不同步。 3、小檗堿促進P53表達,表現(xiàn)出與柔紅霉素一致的時間依賴性,但是對于濃度依賴性二者表達并不一致。 4、小檗堿抑制MDM2的表達,表現(xiàn)出時間依賴性,沒有濃度依賴性；而柔紅霉素抑制MDM2表達表現(xiàn)出不完全時間依賴性和濃度依賴性。 結(jié)論小檗堿作用Jurkat細(xì)胞后通過下調(diào)Survivin.Survivin-△Ex3.MDM2的表達,上 調(diào)Survivin-2B.P53的表達從而抑制其增殖并促進凋亡,呈不完全的時間依賴性和濃 度依賴性,與柔紅霉素作用機制并不一致,提示小檗堿治療對柔紅霉素耐藥的白血病 細(xì)胞,或者與柔紅霉素聯(lián)合治療白血病可能具有一定的臨床價值。 第二部分幾種較為特殊類型兒童急性白血病的臨床回顧性研究 (一)新生兒—過性骨髓增殖異常：單中心回顧性研究 背景 21-三體異常的新生兒大約有10%可能會出現(xiàn)—過性骨髓增殖異常(Transient Abnomal Myelopoiesis, TAM),表現(xiàn)為在出生后的最初的數(shù)天時間內(nèi)外周血出現(xiàn)并迅速積聚大量的原始細(xì)胞,并可能在數(shù)周至數(shù)月內(nèi)自行消失。其中20-30%的患兒在今后數(shù)年內(nèi)繼發(fā)急性巨核細(xì)胞白血病(acute megakaryoblastic leukemia, AMKL)。 目的 探索中國新生兒21-三體染色體異常合并—過性骨髓增殖異常的自然病程,以及繼發(fā)性AMKL的臨床特征、治療方法與長期預(yù)后。 方法 回顧性分析了在香港大學(xué)李嘉誠醫(yī)學(xué)院瑪麗醫(yī)院收治并隨訪的4名21-三體異常合并 —過性骨髓增殖異常的新生兒。 結(jié)果 21-三體是這4例TAM病人原始細(xì)胞唯一確認(rèn)的染色體異常。4名病人均在未接受化療、僅接受對癥治療后外周血原始細(xì)胞自行消失,血細(xì)胞計數(shù)同時恢復(fù)正常。有3名病人繼發(fā)AMKL,其診斷為AMKL的平均年齡為15個月；他們均接受了化療治療。這3名病人均維持至少6年的完全緩解。另外一名未繼發(fā)AMKL的病人僅在其原始細(xì)胞中確定為21-三體的染色體異常,在其外周血原始細(xì)胞消失后體細(xì)胞和白細(xì)胞均未再發(fā)現(xiàn)染色體異常,這名病人也不具有典型Down's綜合癥的外貌。 結(jié)論 4名TAM病人盡管只接受對癥支持治療,仍然取得完全緩解,無1例死亡,其預(yù)后要優(yōu)于文獻報道類似疾病的病人預(yù)后。未來的研究將著重于額外的21號染色體上特定基因在誘發(fā)TAM及可能繼發(fā)AMKL中的作用機制以及可能針對這些特定基因的靶向治療；同時需要多中心合作研究以制定針對中國新生兒TAM以及繼發(fā)AMKL的區(qū)分危險度的個體化治療方案,以期在確保治療效果的同時盡可能減少治療相關(guān)性毒副作用。 (二)嬰兒急性白血病的臨床分析 目的 探討嬰兒白血病(IAL)的臨床表現(xiàn)、細(xì)胞遺傳學(xué)及分子生物學(xué)檢查的特點。方法 對2005年1月1日～2009年12月31日華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬同濟醫(yī)院和武漢市兒童醫(yī)院初診的30例IAL患兒的臨床特征及實驗室檢查資料進行回顧性分析。 結(jié)果 發(fā)熱14例,皮膚出血5例,面色蒼白、面色蒼黃各4例。肝和(或)脾超過肋下5cm 4例；全身淺表淋巴結(jié)腫大8例；雙腎腫大2例；骨質(zhì)破壞5例；中樞神經(jīng)系統(tǒng)浸潤1例,病程2-75d。WBC為(1.06～681.37,中位數(shù)114.78)×109/L；外周血涂片均可見幼稚細(xì)胞；Hb(38～101,中位數(shù)67)g/L；PLT(1～355,中位數(shù)61)×109/。30例LAL患兒中ALL15例,ANLL 14例,分類不明1例。12例獲得免疫表型檢查結(jié)果,5例ALL均為B系,其中CD10表達3例；CD7與CD15共同表達1例；7例AML中CD19表達2例。12例獲得染色體檢查結(jié)果,其中3例異常。有13例IAL行融合基因檢測,結(jié)果E2A/PBX1、BCR/ABL陽性各1例。30例中僅4例ALL接受化療,但最終均放棄治療。而對未治療的26例4周后電話隨訪均死亡 結(jié)論 IAL病人在臨床特征、免疫分型及遺傳學(xué)等方面并沒有表現(xiàn)出特異性。并且由于絕大多數(shù)IAL病人未得到有效化療而導(dǎo)致其預(yù)后較年長兒為差。但本研究樣本量較少,關(guān)于IAL病人化療方案的制定及其長期預(yù)后仍然需要多中心協(xié)作研究解決。 (三)中國青少年急性淋巴細(xì)胞白血病采用兒童化療方案治療的長期效果：單中心回顧性研究 背景 10～18歲青少年急性淋巴細(xì)胞白血病(Acute Lymphoblastic Leukemia, ALL)患者使用兒童化療方案的治療效果明顯優(yōu)于成人化療方案,這表明非骨髓抑制化療藥物的強化治療和更密集的鞘注治療在改善青少年ALL患者預(yù)后的重要性。目的 明確中國青少年ALL患者的生物學(xué)特點和臨床特征,以及使用兒童化療方案治療的長期效果。 方法 對在香港大學(xué)李嘉誠醫(yī)學(xué)院瑪麗醫(yī)院使用兒童化療方案治療并隨訪的19名10～18歲青少年ALL患者進行回顧性分析。 結(jié)果 總共10名男性和9名女性患者接受了治療。4例患者初診時外周血白細(xì)胞計數(shù)100×109/L。4例免疫表型為T-ALL,其余為B-ALL.10例患者確定存在細(xì)胞遺傳學(xué)異常�？诜䴘娔崴芍委�7天后15例患者反應(yīng)良好。治療第33天骨髓檢查有2例沒有緩解。盡管有84%(16/19)的患者獲得完全緩解(Complete Remission, CR),但是有9例出現(xiàn)嚴(yán)重的治療相關(guān)性毒副作用,其中2例死亡。4例復(fù)發(fā),從CR到復(fù)發(fā)的平均時間為35個月(10～63個月)。平均隨訪時間為88個月(5～150個月)。7年總體生存率(Overall Survival,OS)和無事件生存率(Event-free Survival, EFS)分別為89.5±7.0%和72.9±10.4%。 結(jié)論 盡管青少年ALL患者使用兒童化療方案可能出現(xiàn)較明顯的治療相關(guān)性毒副作用,但是其長期預(yù)后令人滿意,并且不需要常規(guī)接受造血干細(xì)胞移植。 (四)造血干細(xì)胞移植在中國嬰兒難治性和/或復(fù)發(fā)性急性白血病治療中的作用：單中心回顧性研究 背景 即使多藥聯(lián)合化療配合造血干細(xì)胞移植(Hematopoietic stem cell transplantation, HSCT)治療難治性/復(fù)發(fā)性白血病使得兒童白血病的長期預(yù)后獲得明顯改善,但是嬰兒難治性和/或復(fù)發(fā)性白血病對于現(xiàn)有的化療方案并沒有從中明顯受益,而HSCT是否有助于改善這一群體的預(yù)后并不清楚。 目的 探討HSCT在改善中國難治性和/或復(fù)發(fā)性嬰兒急性白血病的長期預(yù)后中的作用。方法 回顧性分析8名難治性和/或復(fù)發(fā)性嬰兒急性白血病接受HSCT的治療效果。 結(jié)果 8名病人中4名病人為急性髓系白血病(acute myeloid leukemia, AML),2名為急性淋巴細(xì)胞白血病(acute lymphoblastic leukemia, ALL),1名幼年型單核細(xì)胞白血病(juvenile myelomonocytic leukemia, JMML),1名混合白血病(mixed lineage leukemia).4名病人初診時的白細(xì)胞(white blood cell, WBC)計數(shù)50x109/L。2名病人檢測出MLL基因陽性。4名病人接受了相關(guān)供體HSCT,3名接受了無相關(guān)供體臍血移植,1名接受了無相關(guān)供體HSCT。8名病人中有7名病人移植后中性粒細(xì)胞成功植入,其植入的平均時間為17天。4名病人移植后復(fù)發(fā),盡管其中2名病人接受第2次移植,但是這4名病人全部死亡。另有1名病人死于移植相關(guān)性并發(fā)癥。8名病人對移植的耐受性并不好。4名病人移植后出現(xiàn)4級急性移植物抗宿主病(graft versus host disease, GVHD)。5名病人出現(xiàn)肝靜脈阻塞綜合癥(Venous occlusion disease, VOD)。3名存活的病人全部存在長期后遺癥和/或并發(fā)癥。 結(jié)論 HSCT治療嬰兒難治性和/或復(fù)發(fā)急性白血病仍然面臨嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R733.7

【參考文獻】

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本文編號：2725407