【摘要】： 低堿性磷酸酯酶癥(Hypophospatasia,HPP)是一種常染色體隱性遺傳疾病,由于堿性磷酸酯酶(ALPL)基因突變而導致的以骨骼和牙齒發(fā)育缺陷及血清、骨的組織非特異性堿性磷酸酶(TNAP)活性降低為特征的一種系統(tǒng)性疾病。由于ALPL的等位基因異質(zhì)性,該疾病的臨床表型高度變化,輕者僅表現(xiàn)為乳牙過早脫落,嚴重情況下可出現(xiàn)嚴重骨骼異常及高鈣血癥導致圍產(chǎn)期死亡,目前已發(fā)現(xiàn)214個ALPL基因突變類型可導致HPP疾病的發(fā)生。ALPL編碼的TNAP蛋白不僅在生物礦化過程中具有至關重要作用,而且可能通過影響相關干細胞的生物學行為導致骨骼及牙齒發(fā)育異常。本實驗首先對HPP患兒進行基因突變檢測,進而體外培養(yǎng)和檢測HPP患兒脫落乳牙牙髓干細胞(SHED)以及骨髓間充質(zhì)干細胞(BMMSC),以期探討ALPL基因突變對SHED及BMMSC生物學特性及分化行為的影響,為深入闡明低堿性磷酸酯酶癥的致病機制提供一定實驗依據(jù)和研究基礎。所取的研究結果如下。 實驗一低堿性磷酸酯酶癥患兒致病基因ALPL突變檢測的研究 本實驗通過PCR及基因測序等方法對1名HPP患兒致病基因ALPL基因的外顯子(EXON)進行基因組DNA序列分析,進而檢測基因突變的類型和位點。結果顯示,該HPP患兒ALPL基因的第7個外顯子,基因序列第787位點發(fā)現(xiàn)了一個T→C的錯義突變,為雜合型結構,該點突變導致密碼子TAC→CAC,可引起編碼蛋白第263位點酪氨酸變成組氨酸,而其家系健康成員及正常對照均顯示為野生型序列。經(jīng)過數(shù)據(jù)庫和文獻檢索,本實驗發(fā)現(xiàn)的ALPL基因突變型(c.787TC, p.Y263H)未見報道,初步認為此基因型單倍體不足是導致該HPP患兒臨床表型的致病原因。 實驗二低堿性磷酸酯酶癥患兒乳牙牙髓干細胞的生物學行為研究 本實驗首先進行低堿性磷酸酯酶癥患者乳牙牙髓干細胞和正常乳牙牙髓干細胞的體外培養(yǎng),進而通過免疫細胞化學的方法對兩組細胞表面分子標記物表達分析,采用克隆形成率,Ki67陽性率,MTT,流式細胞方法檢測兩組干細胞增殖能力及凋亡水平的差異,茜素紅染色,Real-time PCR檢測兩組細胞的礦化能力。結果發(fā)現(xiàn):HPP細胞的成骨相關指標ALP、BSP、COL1等蛋白表達水平均略低于正常對照組;而增殖檢測顯示HPP細胞的細胞擴增水平較低;運用茜素紅染色看出HPP細胞形成礦化結節(jié)明顯較少; Real-time PCR檢測發(fā)現(xiàn)RUNX2的mRNA表達下調(diào),而ALP、COL1、DSPP等的表達上調(diào)。結果提示HPP細胞較正常對照組有著較弱的增殖能力和礦化能力。 實驗三低堿性磷酸酯酶癥患兒骨髓間充質(zhì)干細胞的生物學行為研究 本實驗首先體外培養(yǎng)低堿性磷酸酯酶癥患者骨髓間充質(zhì)干細胞和正常骨髓間充質(zhì)干細胞,進而通過免疫細胞化學和流式細胞方法對兩組細胞表面分子標記物表達分析,采用MTT,堿性磷酸酶活性檢測,流式細胞方法檢測兩組干細胞增殖能力及凋亡水平的差異,茜素紅染色,ALP活性染色,Real-time PCR檢測兩組細胞的礦化能力。結果發(fā)現(xiàn):HPP細胞的成骨相關指標ALP、BSP、COL1等蛋白表達水平均略低于正常對照組;流式細胞的表面分子鑒定兩組細胞表達量無明顯差異;而增殖檢測顯示HPP細胞的細胞擴增水平較低;運用茜素紅染色和ALP活性染色看出HPP細胞形成礦化結節(jié)明顯較少;Real-time PCR檢測發(fā)現(xiàn)RUNX2的mRNA表達下調(diào),而ALPL、COL1、BSP等的表達上調(diào)。結果提示HPP細胞較正常對照組有著較弱的增殖能力和礦化能力。
【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2010
【分類號】：R725.9
【圖文】：

患兒ALPL基因EXON7正向測序結果

患兒ALPL基因EXON7反向測序結果

【引證文獻】

相關期刊論文 前1條

1 秦晗;龔永慶;徐宏志;;乳牙早脫1例[J];牙體牙髓牙周病學雜志;2011年06期

本文編號：2724615