發(fā)布時(shí)間：2020-06-15 10:40

【摘要】： 前言 慢性肺疾病(chronic lung disease, CLD)是患有心肺疾病的新生兒,特別是早產(chǎn)兒,因長(zhǎng)時(shí)間吸入高濃度氧或機(jī)械通氣治療而導(dǎo)致的一種嚴(yán)重的并發(fā)癥。近年來(lái),新生兒和早產(chǎn)兒管理技術(shù)的不斷提高,使得低出生體重兒的存活率不斷增加,CLD的發(fā)病率也呈上升趨勢(shì)。據(jù)報(bào)道,出生體重小于750克的病人發(fā)生率大于50%,751-1000克病人的發(fā)生率為34%,1001-1250克的病人發(fā)生率為15%,1251-1500克的發(fā)生率為7%。其中,重者生后一年內(nèi)死于呼吸衰竭,存活者也需長(zhǎng)期(數(shù)月或數(shù)年)依賴氧氣或機(jī)械通氣治療。CLD的最終結(jié)局為不可逆的肺間質(zhì)纖維化,使患兒肺功能受損,最終嚴(yán)重影響了其生存質(zhì)量。目前,CLD的發(fā)病機(jī)制尚不清楚,且仍無(wú)理想的防治措施,故探索CLD肺纖維化的發(fā)生機(jī)制成為當(dāng)今新生兒領(lǐng)域亟待解決的問(wèn)題。 現(xiàn)研究認(rèn)為,CLD肺纖維化的發(fā)病機(jī)理為肺成纖維細(xì)胞異常增殖,造成細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)合成及降解失衡,而對(duì)其發(fā)生機(jī)制的研究多集中于細(xì)胞因子水平。在眾多的細(xì)胞因子中,因?yàn)檗D(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(transforming growth factor, TGF-β1)與纖維化的關(guān)系比較明確,所以其發(fā)生作用的機(jī)制成為研究的熱點(diǎn)。 目前有研究發(fā)現(xiàn),調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖的最終環(huán)節(jié)發(fā)生在細(xì)胞周期水平上。正常細(xì)胞周期包括G1、S、G2和M四個(gè)時(shí)相。期間存在多個(gè)調(diào)控點(diǎn)調(diào)節(jié)各時(shí)相間的轉(zhuǎn)換,其中較為關(guān)鍵的是G1→S和G2→M這兩個(gè)調(diào)控點(diǎn),尤以G1→S最為重要。其通過(guò)接受細(xì)胞周期蛋白構(gòu)成的網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)系統(tǒng)作用,發(fā)揮細(xì)胞周期調(diào)控功能。在腎纖維化及肝纖維化領(lǐng)域,均有TGF-β1通過(guò)調(diào)節(jié)相應(yīng)細(xì)胞的細(xì)胞周期調(diào)控分子(Cyclin、CDK、CDKI)的表達(dá)參與細(xì)胞增殖,促進(jìn)纖維化的發(fā)生、發(fā)展的相關(guān)報(bào)道。其中,因?yàn)榧?xì)胞周期蛋白依賴性激酶-2(Cyclin-dependent kinases 2, CDK2)及細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子-27(Cyclin-dependent kinase inhibitor 27,P27)發(fā)揮重要的調(diào)控功能而研究較多。那么,在高氧致新生兒CLD肺纖維化發(fā)生中,CDK2及P27的作用如何呢?因此,本研究基于我們前期的研究結(jié)果,通過(guò)應(yīng)用免疫組化、Real-Time PCR等技術(shù),試圖闡明高氧致新生鼠CLD模型中CDK2及P27的表達(dá)規(guī)律,以及TGF-β1對(duì)體外培養(yǎng)新生鼠肺成纖維細(xì)胞增殖的影響作用,以期為尋找新的防治途徑奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 材料與方法 一、動(dòng)物實(shí)驗(yàn) (一)實(shí)驗(yàn)分組及動(dòng)物模型的制備 將自然分娩的新生鼠,隨機(jī)分為兩組,即實(shí)驗(yàn)組(高氧組)和對(duì)照組(空氣組),每組均為32只。實(shí)驗(yàn)組將新生鼠(連同母鼠)生后立即置于氧箱中,持續(xù)輸入氧氣,維持FiO2為0.90,用鈉石灰吸收C02,使其濃度小于0.5%,溫度為25-27℃,濕度50%-70%,每天定時(shí)開箱30 min,添加水、飼料及更換墊料,并與對(duì)照組交換母鼠,以避免其因氧中毒致喂養(yǎng)能力下降。對(duì)照組置于空氣中,具體方法及實(shí)驗(yàn)控制因素同高氧組。 (二)標(biāo)本的采集和處理 實(shí)驗(yàn)3、7、14、21天分別從2組中隨機(jī)抽取8只,用10%水合氯醛麻醉致死后立即打開胸腔,分離肺組織。將左肺置于4%多聚甲醛中固定,右肺置于-80℃冰箱凍存,用于HE染色、免疫組化及PCR檢測(cè)。 二、體外實(shí)驗(yàn) (一)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 自然分娩的新生鼠,雌雄不限。 (二)肺成纖維細(xì)胞的分離及培養(yǎng) 將新生鼠用10%水合氯醛麻醉致死,75%酒精中浸泡后,迅速打開胸腔,無(wú)菌取出肺組織,分離肺成纖維細(xì)胞。將分離成功的肺成纖維細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)、傳代,于第3代細(xì)胞進(jìn)行TGF-β1對(duì)肺成纖維細(xì)胞的干預(yù)實(shí)驗(yàn)。 (三)TGF-β1刺激實(shí)驗(yàn)及取材 當(dāng)傳代細(xì)胞(第3代)至細(xì)胞融合達(dá)70%左右,更換為無(wú)血清培養(yǎng)液,24小時(shí)后進(jìn)行分組實(shí)驗(yàn)。在21%氧濃度條件下,分別用0ng/ml(加入等量的無(wú)細(xì)胞因子培養(yǎng)液)、1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml的TGF-β1作用于第3代肺成纖維細(xì)胞,于24小時(shí)收集細(xì)胞。分別按實(shí)驗(yàn)方法要求保存標(biāo)本。 用10ng/ml的劑量作用第3代肺成纖維細(xì)胞,分別于12、24、48小時(shí)進(jìn)行細(xì)胞收集,同時(shí)在這三個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)立對(duì)照組(加入等量的無(wú)細(xì)胞因子培養(yǎng)液)。分別按實(shí)驗(yàn)方法要求保存標(biāo)本。 三、實(shí)驗(yàn)方法及指標(biāo)檢測(cè) (一)肺組織形態(tài)學(xué)研究 光鏡下觀察肺組織形態(tài)學(xué)改變。 (二)肺纖維化評(píng)分 采用Ashcroft等人的方法進(jìn)行纖維化評(píng)分,判斷肺纖維化的程度。 (三)免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)肺組織CDK2及P27蛋白的表達(dá) 采用SP免疫組織化學(xué)技術(shù),于每個(gè)時(shí)間點(diǎn)隨機(jī)抽取染色清晰的切片8張,每張切片于光鏡下(×400)隨機(jī)選取5個(gè)視野,固定窗口面積,以胞漿和/或胞核中有棕黃色顆粒為陽(yáng)性細(xì)胞,其蛋白的定量測(cè)定利用美國(guó)Universal Imaging Porpomtion圖象分析系統(tǒng),應(yīng)用Meta Morph軟件分析圖像平均灰度值,用來(lái)表示CDK2及P27表達(dá)的強(qiáng)度,平均灰度值與蛋白表達(dá)水平呈反比。 (四)實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測(cè)肺組織CDK2及P27基因表達(dá) 實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù),先構(gòu)建目的基因和管家基因的RNA標(biāo)準(zhǔn)品,制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,利用標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)樣品中的目的基因和管家基因分別進(jìn)行定量。通過(guò)管家基因的校正,檢測(cè)各組肺組織中CDK2及P27基因的相對(duì)表達(dá)量。 (五)波形蛋白免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)(成纖維細(xì)胞鑒定) 收集第3代肺成纖維細(xì)胞,用SP及免疫熒光法對(duì)成纖維細(xì)胞中的波形蛋白進(jìn)行染色,光鏡下觀察、鑒定成纖維細(xì)胞。 (六)Cell Counting Kit-8(CCK-8試劑盒)檢測(cè)細(xì)胞增殖 取第3代肺成纖維細(xì)胞調(diào)整細(xì)胞濃度至5000個(gè)/100μL,以每孔100μL接種于96孔板,分別以上述濃度和時(shí)間的TGF-β1作用于孔內(nèi)細(xì)胞后每孔加入CCK-810μL,37℃5%CO2孵育箱內(nèi)繼續(xù)孵育,1小時(shí)后450nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度(OD值)。 (七)流式細(xì)胞儀檢測(cè)肺成纖維細(xì)胞細(xì)胞周期的變化 取TGF-β1作用后的成纖維細(xì)胞,70%乙醇4℃固定,加RNase A于37℃水浴中消化30min。加入PI,放置暗處30 min,流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期變化。 (八)免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)檢測(cè)肺成纖維細(xì)胞CDK2及P27蛋白表達(dá) 采用SP免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù),每個(gè)時(shí)間點(diǎn)隨機(jī)抽取染色清晰的切片4張,每張切片于光鏡下(×400)隨機(jī)選取5個(gè)視野,固定窗口面積,以胞漿和/或胞核中有棕黃色顆粒為陽(yáng)性細(xì)胞,其蛋白的定量測(cè)定利用美國(guó)Universal Imaging Porpomtion圖象分析系統(tǒng),應(yīng)用Meta Morph軟件分析圖像平均灰度值,用來(lái)表示CDK2及P27表達(dá)的強(qiáng)度,平均灰度值與蛋白表達(dá)水平呈反比。 (九)實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測(cè)成纖維細(xì)胞CDK2及P27基因表達(dá) 實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù),先構(gòu)建目的基因和管家基因的RNA標(biāo)準(zhǔn)品,制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,利用標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)樣品中的目的基因和管家基因分別進(jìn)行定量。通過(guò)管家基因的校正,檢測(cè)各組細(xì)胞中CDK2及P27基因的相對(duì)表達(dá)量。 四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)均以x±S表示,應(yīng)用SPSS14.0對(duì)各組間數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,兩樣本方差齊性檢驗(yàn)采用F檢驗(yàn),根據(jù)樣本的方差齊性檢驗(yàn)F值,兩組間比較分別應(yīng)用t檢驗(yàn)或t'檢驗(yàn),相關(guān)性分析采用spearman分析,多組間比較采用方差分析,以P＜0.05表示差異有顯著性。 結(jié)果 一、肺組織形態(tài)觀察 生后3天時(shí)空氣組肺泡間隔變薄,肺泡結(jié)構(gòu)漸規(guī)整,大小較均勻,高氧組肺泡間隔有少許炎性細(xì)胞滲出,肺泡腔內(nèi)有少許紅細(xì)胞滲出；7-21天空氣組肺泡間隔變薄,肺泡結(jié)構(gòu)逐漸規(guī)整；高氧組7天時(shí),可見肺水腫,間質(zhì)細(xì)胞增多,炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等；14天時(shí),肺間質(zhì)成纖維細(xì)胞增加,肺泡間隔明顯增厚,肺纖維化逐漸形成;21天時(shí),肺泡間隔增寬,肺間質(zhì)細(xì)胞明顯增多,肺泡正常結(jié)構(gòu)消失,肺纖維化形成。 二、肺組織纖維化評(píng)分 與對(duì)照組相比,14、21天時(shí)實(shí)驗(yàn)組肺纖維化評(píng)分有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,P＜0.05。 三、肺組織CDK2及P27蛋白的表達(dá) (一)表達(dá)部位 空氣組CDK2在血管內(nèi)皮細(xì)胞,支氣管和細(xì)支氣管上皮細(xì)胞有微弱表達(dá)。高氧組3天表達(dá)與對(duì)照組相似；7天時(shí)可見肺上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞表達(dá)微弱的CDK2；14天時(shí),在肺上皮細(xì)胞和間質(zhì)成纖維細(xì)胞中表達(dá)均明顯增強(qiáng)；21天時(shí),CDK2在這些細(xì)胞中的表達(dá)進(jìn)一步增強(qiáng),肺成纖維細(xì)胞為其主要表達(dá)細(xì)胞。 空氣組P27在血管內(nèi)皮細(xì)胞,支氣管,細(xì)支氣管上皮細(xì)胞和肺成纖維細(xì)胞有表達(dá)。高氧組3天表達(dá)與對(duì)照組相似；7天時(shí)可見肺上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞表達(dá)P27減弱;14天時(shí),在肺上皮細(xì)胞和間質(zhì)成纖維細(xì)胞中表達(dá)均明顯減弱；21天時(shí),P27在這些細(xì)胞中的表達(dá)進(jìn)一步減弱。 (二)表達(dá)強(qiáng)度檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)開始后3、7天實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組肺組織CDK2及P27表達(dá)強(qiáng)度無(wú)顯著差異(P＞0.05)；隨著日齡的增加,實(shí)驗(yàn)組CDK2表達(dá)逐漸增強(qiáng),P27表達(dá)逐漸減弱,14、21天時(shí)與對(duì)照組相比,P值均＜0.05。 四、肺組織CDK2及P27基因的表達(dá) 實(shí)驗(yàn)開始后3、7天實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組肺組織CDK2及P27基因表達(dá)強(qiáng)度無(wú)顯著差異(P＞0.05)；14天實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組CDK2分別為：16.05±6.17和6.94±3.42,P27分別為：33.16±7.61和51.51±8.56(P＜0.05)；21天CDK2分別為：27.06±10.65和8.24±3.60,21天P27分別為：14.82±3.34和41.36±13.05(P＜0.05)。 五、相關(guān)性分析 采用spearman方法進(jìn)行相關(guān)性分析,高氧暴露下新生鼠肺組織CDK2表達(dá)與纖維化評(píng)分呈明顯正相關(guān)(r1=0.784,r2=0.702,P0.05),P27表達(dá)與纖維化評(píng)分 呈明顯負(fù)相關(guān)(r1=-0.819,r2=-0.765,P0.05)。 六、成纖維細(xì)胞鑒定 倒置顯微鏡下可見成纖維細(xì)胞呈梭形(×100),經(jīng)免疫組化染色可見成纖維細(xì)胞胞漿被染成棕黃色(×400),經(jīng)免疫熒光染色可見成纖維細(xì)胞胞漿顯現(xiàn)綠色熒光(×400)。 七、TGF-β1刺激下肺成纖維細(xì)胞增殖情況 隨著TGF-β1刺激濃度的增加,肺成纖維細(xì)胞24小時(shí)OD值分別為0.251±0.0230.318±0.023、0.418±0.028、0.470±0.014,與0ng/ml組進(jìn)行比較5ng/ml、10ng/ml組P值均＜0.05,而1ng/ml組P值＞0.05；組間比較,P值均＜0.05。隨著TGF-β1刺激時(shí)間的增加,肺成纖維細(xì)胞不同時(shí)間OD值分別為0.362±0.048、0.470±0.014、0.684±0.119,與同時(shí)間對(duì)照組相比P值均＜0.05；組間比較,P值均＜0.05。 八、TGF-β1刺激下肺成纖維細(xì)胞周期的變化 在0ng/ml、1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml的TGF-β1刺激下,肺成纖維細(xì)胞24小時(shí)G0/G1期比例呈逐漸降低趨勢(shì),S期比例呈逐漸升高趨勢(shì),與0ng/ml組進(jìn)行比較5ng/ml、10ng/ml組P值均＜0.05,而1ng/ml組P值＞0.05；組間比較,P值均＜0.05。分別用10ng/ml及0ng/ml的TGF-β1刺激肺成纖維細(xì)胞,分別于12、24、48小時(shí)測(cè)定各細(xì)胞周期,各時(shí)間點(diǎn)G0/G1期及S期比例與對(duì)照組相比P值均0.05；組間比較P值均0.05。 九、TGF-β1刺激下肺成纖維細(xì)胞CDK2及P27蛋白的表達(dá) 在0ng/ml、1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml的TGF-β1刺激下,肺成纖維細(xì)胞24小時(shí)CDK2蛋白表達(dá)與刺激濃度呈正比,P27蛋白表達(dá)與刺激濃度呈反比,與0ng/ml組進(jìn)行比較,5ng/ml、10ng/ml組P值均0.05,而1ng/ml組P值0.05；對(duì)1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml的TGF-β1刺激下24小時(shí)CDK2及P27蛋白的表達(dá)進(jìn)行組間比較,P值均0.05。分別用10ng/ml及0ng/ml的TGF-β1刺激肺成纖維細(xì)胞,分別于12、24、48小時(shí)測(cè)定CDK2及P27蛋白的表達(dá),CDK2表達(dá)與刺激時(shí)間呈正比,P27與刺激時(shí)間呈反比,與同期對(duì)照相比P均0.05；對(duì)10ng/ml刺激下12、24、48小時(shí)CDK2及P27蛋白表達(dá)進(jìn)行兩兩比較,P值均0.05。 十、TGF-β1刺激下肺成纖維細(xì)胞CDK2及P27 mRNA的表達(dá) 在0ng/ml、1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml的TGF-β1刺激下,肺成纖維細(xì)胞24小時(shí)CDK2mRNA表達(dá)與刺激濃度呈正比,P27mRNA表達(dá)與刺激濃度呈反比,與0ng/ml組進(jìn)行比較,5ng/ml、10ng/ml組P值均0.05,而1ng/ml組P值＞0.05；組間比較,P值均＜0.05。分別用10ng/ml及0ng/ml的TGF-β1刺激肺成纖維細(xì)胞,分別于12、24、48小時(shí)測(cè)定CDK2及P27mRNA的表達(dá),CDK2表達(dá)與刺激時(shí)間呈正比,P27與刺激時(shí)間呈反比,與同期對(duì)照相比P值均＜0.05；對(duì)10ng/ml刺激下12、24、48小時(shí)CDK2及P27mRNA表達(dá)進(jìn)行兩兩比較,P值均＜0.05。 結(jié)論 1、在高濃度氧誘導(dǎo)新生鼠肺纖維化模型中,隨著高氧暴露時(shí)間延長(zhǎng),肺組織CDK2蛋白及基因表達(dá)逐漸上升,P27蛋白及基因的表達(dá)逐漸下降。 2、TGF-β1作用肺成纖維細(xì)胞的體外實(shí)驗(yàn),證實(shí)TGF-β1可能通過(guò)上調(diào)CDK2表達(dá)下調(diào)P27的表達(dá),刺激成纖維細(xì)胞增殖。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R722.1
【圖文】：

不同濃度TGF一印作用24小時(shí)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期比例A:Ong/ml作用24小時(shí)，Gl期所占比例為83.67%，S期所占比例為4.63%B:sn留ml作用24小時(shí)，Gl期所占比例為75.33%，S期所占比例為7.38%C:10ng/ml作用24小時(shí)，GI期所占比例為67.09%，，S期所占比例為8.76%D團(tuán)幻日1曰比日nne污『U一沖

比日nne污『U一沖扣氣a，l界u均團(tuán)“刃、n、舞u均… ABC圖17， 10ng/mlTGF一困作用不同時(shí)間，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期比例 A:10ng/ml作用12小時(shí)，GI期所占比例為73.99%，S期所占比例為7.64%; B:10ng加l作用24小時(shí)，GI期所占比例為67.09%，S期所占比例為5.76%: C:10ng加1作用48小時(shí)，GI期所占比例為59.81%

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2714299