發(fā)布時間：2020-06-13 13:56

【摘要】： 第一部分甲基丙二酸對大鼠心肌線粒體呼吸鏈復(fù)合酶Ⅱ的影響 【目的】甲基丙二酸尿癥患者常常出現(xiàn)基底神經(jīng)節(jié)特別是蒼白球的變性壞死,研究顯示這種特發(fā)性的神經(jīng)損害可能與該病中累積的甲基丙二酸(MMA)、丙二酸、2-甲基檸檬酸等內(nèi)源性毒性產(chǎn)物影響線粒體呼吸鏈的能量代謝及三羧酸循環(huán)有關(guān)。本次研究旨在探討甲基丙二酸在線粒體能量代謝中的作用及可能的神經(jīng)毒性作用機制。 [方法]使用差速離心法在體外構(gòu)建大鼠心肌線粒體模型,用Bradford蛋白濃度測定法測定和調(diào)節(jié)線粒體蛋白濃度。用分光光度法和Western blot方法分別測定不同濃度(0mM,1 mM,2.5 mM和5 mM)和不同時間(30min,2 h,4h和8 h)孵育的甲基丙二酸對大鼠心肌線粒體呼吸鏈復(fù)合酶Ⅱ(complex II)的活性改變和其兩種蛋白亞基鐵硫蛋白30亞基(IP)、黃素蛋白70亞基(FP)表達(dá)水平的影響。 [結(jié)果]1.酶活性檢測結(jié)果①甲基丙二酸孵育30 min和2 h時,各不同濃度處理組(1 mM,2.5 mM,5mM)的complexⅡ活性與對照組相比均無顯著性降低(P均0.05)；②甲基丙二酸孵育4 h時,各不同濃度處理組的complexⅡ活性與對照組相比均有明顯降低(P均0.05)；③甲基丙二酸孵育時間延長至8 h時,低劑量甲基丙二酸處理組(1 mM)的complexⅡ活性與對照組相比無顯著性降低(P0.05),而中、高劑量組(2.5 mM,5mM)與對照組相比則有顯著降低(P均0.05)；④甲基丙二酸孵育30min,2 h,4 h時各不同MMA濃度組的complexⅡ的活性值處于較穩(wěn)定的水平,未見明顯降低(P均0.05)；當(dāng)孵育時間增加到8 h時,各濃度組的complexⅡ的活性值可見明顯下降(P均0.05)。2. Western blot檢測蛋白表達(dá)結(jié)果①MMA孵育30min時,各不同濃度的甲基丙二酸處理組(1 mM,2.5 mM,5 mM)的FP和IP表達(dá)水平均未見顯著下調(diào)(P均0.05)；②甲基丙二酸孵育2 h時,各不同濃度的甲基丙二酸處理組(1 mM,2.5 mM,5 mM)的IP表達(dá)水平未見明顯下調(diào)(P均0.05),FP表達(dá)水平各組均有明顯下調(diào)(P均0.05)；③MMA孵育4 h時,各不同濃度的甲基丙二酸處理組(1 mM,2.5 mM,5 mM)的IP表達(dá)水平未見明顯下調(diào)(P均0.05),FP表達(dá)水平各組均有明顯下調(diào)(P均0.05)；④MMA孵育8 h時,各不同濃度的甲基丙二酸處理組(1mM,2.5 mM,5mM)的FP表達(dá)水平各組均有明顯下調(diào)(P均0.05),低劑量處理組(1 mM)的IP表達(dá)水平與對照組相比沒有顯著性差異(P0.05),但中、高劑量處理組(2.5 mM和5 mM)IP表達(dá)水平較對照組有明顯下調(diào)(P)均0.05)。 【結(jié)論】甲基丙二酸可引起線粒體呼吸鏈復(fù)合酶Ⅱ蛋白亞基IP和FP表達(dá)的下調(diào)及線粒體呼吸鏈復(fù)合酶活性降低,但存在時間依賴性和濃度依賴性的協(xié)同作用,這可能是甲基丙二酸引起線粒體能量代謝障礙和神經(jīng)損傷的直接作用機制之一。 第二部分甲基丙二酸尿癥患兒的臨床特點以及基因突變分析 【目的】甲基丙二酸尿癥是由甲基丙二酰輔酶A缺陷或其輔因子腺苷鈷胺素代謝缺陷所致的一類遺傳代謝缺陷病。根據(jù)不同病因可分為mut型(mut0和mut-型)和Cbl型(Cb1A、Cb1B、Cb1C、Cb1D、Cb1F和Cb1H型)。其中mut型是最多見的一種類型,其編碼基因為位于6號染色體的MUT基因,目前在mut型病人中已發(fā)現(xiàn)的MUT基因突變已達(dá)200多種。本研究的目的旨在探討華中地區(qū)甲基丙二酸尿癥患兒臨床特點與基因突變特點,并分析兩者之間的相關(guān)性。 【方法】收集近年來在本院通過氣相色譜-質(zhì)譜分析技術(shù)(GC/MS)確診為甲基丙二酸尿癥患者(共18例)及雙親(共5對)的外周血標(biāo)本,記錄起病年齡、主要臨床表現(xiàn)、生化異常、維生素B12反應(yīng)性、治療及隨訪等臨床資料。使用傳統(tǒng)方法從EDTA抗凝的外周血白細(xì)胞中提取DNA,針對編碼甲基丙二酰輔酶A的MUT基因編碼區(qū)外顯子2-13及其鄰近的內(nèi)含子區(qū)域設(shè)計引物,PCR擴增純化后應(yīng)用Beckman CEQ8800基因分析系統(tǒng)直接進(jìn)行測序,檢測基因突變位點。 【結(jié)果】1.患者主要臨床特征：18例患者(男13例,女5例)起病年齡在2天～14個月之間,臨床表現(xiàn)以肌無力、喂養(yǎng)困難、嘔吐、感染為主,生化異常以代謝性酸中毒和高氨血癥最為常見。16號和17號患者為雙胞胎兄弟,10號和12號患者均存在可能與本病相關(guān)的異常家族史。12名患者對維生素B12試驗性治療無反應(yīng)性,3名患者有反應(yīng)性,3名患者未檢測。至本研究終止時已有14例患者死亡,存活者僅4例。2.基因突變特征：所有患者和家長DNA中均檢測到基因突變或多態(tài)性,共14種,具體見下①6種為未報道的新突變,分別為c.424AG(p.T142A)、c.786TG (p.S262R)、c.808GC (p.G270R)、c.1323_1324insA、c.1445-1GA和c.1676+77AC,均為雜合突變；②其余8種突變和多態(tài)性分別為C.323GA (p.R108H)、c.636AG (p.K212K)、c.682CT (p.R228X)、c.1495GA (p.A499T)、c.1595AG (p.H532R)、c.1992GA (p.A664A)、c.2011GA (p.V671I)和c.1677-53AG,大部分為雜合突變；③5個家系分析中共發(fā)現(xiàn)7種突變,分別為c.636AG (p.K212K)、(p.A499)、c.1595AG (p.H532R)、c.1992GA (p.A664A)、c.2011GA(p.V671I)、c.1677-53AG和c.1676+77AC,僅一種為新突變,患兒的突變均來自于父方或母方。 [結(jié)論]本次研究發(fā)現(xiàn)了MUT基因6種目前尚未報道過的新突變,更新了MUT基因的突變譜；華中地區(qū)甲基丙二酸尿癥患兒的主要致病基因突變類型可能與三種多態(tài)性(p.K212K、p.H532R和p.V671I)與其它突變相伴存在密切相關(guān)。
【圖文】：

eontroll田 M2.5.M5口MMM幾濃度圖1一 2MMA孵育 30min時各不同濃度組的comPlexn活性②MMA孵育Zh時，各不同濃度的甲基丙二酸處理組 (lmM，， 2.5mM， 5mM)的eo哪 lex11的活性值分別為7.95士 1.52、6.90士 1.35、6.73士一15和6.19士0.95(IunOI加i川mg蛋白)，統(tǒng)計學(xué)分析 F=2.82， P>0.05，各處理組與對照組相比仍然沒有顯著性差異。吐ORJ

本文編號：2711278