【摘要】：研究背景:孤獨(dú)癥譜系障礙(Autism Spectrum Disorder,ASD)是復(fù)雜的神經(jīng)發(fā)育障礙性疾病,具有高度的病因和臨床異質(zhì)性,其特征是兒童早期的社會(huì)交流障礙、刻板重復(fù)行為及狹隘興趣。近年來(lái),世界各國(guó)報(bào)道的ASD發(fā)病率呈急劇上升的趨勢(shì),2018年美國(guó)疾病控制與預(yù)防中心的調(diào)查結(jié)果顯示已達(dá)1/59,超過(guò)兒童癌癥、糖尿病及艾滋病三者的總和。ASD的高發(fā)病率及致殘率給個(gè)人、家庭和社會(huì)造成巨大的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)負(fù)擔(dān),已經(jīng)成為危害嚴(yán)重的全球公共衛(wèi)生問(wèn)題。但至今ASD病因未明,尚無(wú)有效和針對(duì)性的治療和干預(yù)方法。過(guò)去十年,ASD的研究主要集中在遺傳基因方面,流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示遺傳因素在ASD的發(fā)病中起到非常重要的作用,但遺傳病的發(fā)病率是相對(duì)穩(wěn)定的,ASD出現(xiàn)的這樣一個(gè)快速上升的現(xiàn)象,單靠遺傳學(xué)分析并不能解釋其根本原因,也并不符合遺傳病發(fā)病的規(guī)律。針對(duì)ASD病因?qū)W的研究,目前主要認(rèn)為遺傳和環(huán)境因素相互作用,共同在ASD的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用。腸道菌群被稱為“第二基因組”,隨著腸道菌群與ASD研究的不斷深入及近年來(lái)菌群測(cè)序技術(shù)的發(fā)展,越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)ASD兒童存在胃腸道疾病及腸道菌群紊亂。腸道菌群通過(guò)神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)及免疫系統(tǒng)影響大腦發(fā)育及功能,它們之間相互作用構(gòu)成微生物-腸-腦軸,微生物-腸-腦軸失衡可影響人類(lèi)的認(rèn)知和行為,導(dǎo)致ASD。近年來(lái)多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn),胎兒期很多因素可觸發(fā)母親一系列免疫反應(yīng),這些免疫反應(yīng)可能增加ASD的患病風(fēng)險(xiǎn)。產(chǎn)前和孕期的多種影響因素都有可能影響孩子的神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育,如產(chǎn)前免疫應(yīng)激、懷孕期肥胖、精神緊張、各種胃腸道癥狀等圍產(chǎn)期和產(chǎn)后健康狀況等都將增加幼兒患ASD等神經(jīng)障礙性疾病的風(fēng)險(xiǎn)。大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明,孕期母親腸道菌群變化與子代ASD的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。改變腸道菌群并進(jìn)行菌群重構(gòu),已被證明可以逆轉(zhuǎn)母體因素導(dǎo)致的后代社交缺陷,且對(duì)小鼠和人類(lèi)的ASD行為都有有益的影響。兒童腸道菌群紊亂引起ASD的研究屢見(jiàn)不鮮,但目前缺少ASD兒童的母子腸道菌群相關(guān)性的研究。為數(shù)不多的流行病學(xué)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究不足以支持母親腸道菌群紊亂與后代神經(jīng)發(fā)育障礙相關(guān)。因此尚不清楚ASD兒童腸道菌群與母親腸道菌群的相關(guān)性及菌群結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。而且ASD兒童腸道菌群與其母親及健康兒童相比,其獨(dú)特的細(xì)菌標(biāo)志物尚未被發(fā)現(xiàn)。研究目的:探索ASD母子腸道菌群多樣性及菌群結(jié)構(gòu)特點(diǎn);篩選與ASD臨床指標(biāo)相關(guān)的獨(dú)特的細(xì)菌生物標(biāo)志物;探討利用腸道菌群獨(dú)特的細(xì)菌生物標(biāo)志物對(duì)ASD兒童的早期篩查與診斷作用。研究方法:實(shí)驗(yàn)對(duì)象為2016年07月至2017年02月于山東大學(xué)齊魯兒童醫(yī)院兒童保健所確診、兒童保健所孤獨(dú)癥康復(fù)訓(xùn)練中心(濟(jì)南市特殊幼兒園)康復(fù)訓(xùn)練的ASD兒童及其母親。健康對(duì)照組為山東大學(xué)齊魯兒童醫(yī)院健康醫(yī)護(hù)人員及其子女。選取符合入組標(biāo)準(zhǔn)的89對(duì)母子收取糞便樣本,其中59對(duì)ASD母子和30對(duì)匹配的健康母子。采集研究對(duì)象臨床信息,其中ASD兒童平均年齡4歲(2-7歲),匹配健康兒童平均年齡5歲(2-10歲);ASD兒童母親平均年齡33歲(26-38歲),健康兒童母親平均年齡31歲(27-42歲)。16S rRNA基因V1-V2區(qū)擴(kuò)增子測(cè)序用來(lái)測(cè)定ASD母子及健康母子的腸道菌群,用線性判別分析效應(yīng)大小(Linear discriminant analysis and Effect Size,LEfSe)分析 ASD 兒童腸道菌群潛在的細(xì)菌生物標(biāo)志物,R package e1071支持向量機(jī)分類(lèi)器對(duì)選擇的細(xì)菌生物標(biāo)志物進(jìn)行分類(lèi)分析,使用ROCR R包計(jì)算受試者工作特征曲線(Receiver operating characteristics,ROC)和曲線下面積(Area under the curve,AUC),并且評(píng)估細(xì)菌生物標(biāo)志物在ASD臨床診斷中的價(jià)值。本研究中,ASD兒童(ASD-C)與健康兒童(H-C)匹配、ASD兒童母親(ASD-M)與健康兒童母親(H-M)匹配、ASD兒童母子(ASD-M+C)與健康兒童母子(H-M+C)匹配開(kāi)展相關(guān)研究。研究結(jié)果:本研究展示了 ASD-C的腸道菌群結(jié)構(gòu)特征。通過(guò)Alpha多樣性分析(α多樣性分析),我們發(fā)現(xiàn)ASD-C腸道菌群細(xì)菌豐度顯著增加(P0.01),但ASD-C的腸道菌群的多樣性與H-C差異不顯著(P=0.13)。根據(jù)可操作分類(lèi)單元(operational taxonomic unit,OTU)的分類(lèi),我們發(fā)現(xiàn)厚壁菌門(mén)/擬桿菌門(mén)(Firmicutes/Bacteroidetes)在門(mén)級(jí)水平無(wú)顯著差異(P0.05),但屬級(jí)水平發(fā)現(xiàn)變形菌門(mén)(Proteobacteria)在ASD-C的腸道菌群中的含量較高,與H-C相比具有顯著差異(P0.01)。Beta多樣性分析(β多樣性分析)顯示ASD-C與H-C的腸道菌群表現(xiàn)出了明顯的聚類(lèi),揭示了 ASD-C與H-C的腸道菌群具有顯著的差異性(ANOSIM,r=0.197,P0.01)。LEfSe分析ASD-C腸道菌群的特征微生物群譜和主要的細(xì)菌生物標(biāo)志物,結(jié)果顯示ASD-C腸道中顯著增加的菌屬:產(chǎn)堿菌科(Alcaligenaceae)、棲水菌屬(Enhydrobacter)、金黃桿菌屬(Chryseobacterium)、鏈球菌屬(Streptococcus)、不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)、嗜硒微生物(Wautersiella)、土壤桿菌屬(Agrobacterium)、Parabacteroides 及約氏不動(dòng)桿菌(Acinetobacter johnsonii)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)了 ASD-C腸道內(nèi)豐度降低的菌屬:普氏菌屬(Prevotella)。分析ASD-M與H-M的腸道菌群結(jié)構(gòu)特征,發(fā)現(xiàn)二者腸道菌群群落結(jié)構(gòu)也存在差異。α多樣性分析顯示,ASD-M腸道菌群細(xì)菌豐度顯著上升(P0.05),但兩組間腸道菌群多樣性無(wú)顯著差異(P=0.35)。接著我們對(duì)門(mén)級(jí)和屬級(jí)OTU分類(lèi)進(jìn)行對(duì)比,發(fā)現(xiàn)兩組腸道菌群細(xì)菌豐度均差異顯著。β多樣性分析顯示兩組腸道菌群表現(xiàn)出了明顯的聚類(lèi),揭示了 ASD-M與H-M的腸道菌群具有顯著的差異性(ANOSIM,r=0.248,P0.01)。LEfSe 分析顯示莫拉氏菌科(Moraxellaceae)、腸桿菌科(Enterobacteriaceae)(科)和不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)(屬)在ASD-M的腸道內(nèi)顯著增加,而糞桿菌屬(Faecalibacterium)顯著降低。我們進(jìn)一步分析ASD-M+C與H-M+C腸道菌群的結(jié)構(gòu)特征。a多樣性分析顯示,基于PD_whole_tree指數(shù)所做的箱線圖數(shù)值相近,秩和檢驗(yàn)(Wilcoxon ranksum tests)表明兩組間腸道菌群多樣性存在顯著差異(P0.01)。ACE指數(shù)(Abundance-based coverage estimator indexes)進(jìn)一步證實(shí)上述結(jié)果。β多樣性分析顯示ASD-M+C與H-M+C的腸道菌群差異有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(ANOSIM,r=0.191,P0.01)。隨后,我們使用篩選的細(xì)菌生物標(biāo)志物評(píng)估兩組腸道菌群的相關(guān)性,結(jié)果顯示兩組間兒童及母親腸道菌群表現(xiàn)出明顯聚類(lèi)。本研究進(jìn)一步分析了 ASD-C與ASD-M腸道菌群的差異,發(fā)現(xiàn)產(chǎn)堿菌科(Alcaligenaceae)、梭菌屬(Clostridium)、嗜血桿菌(Haemophilus)、Wautersiella僅在ASD-C的腸道相對(duì)豐度升高,然而普氏菌屬(Prevotella)、瘤胃球菌屬(Ruminococcus)僅在ASD-C腸道菌群中豐度降低。接著,我們使用韋恩圖對(duì)不同分組之間相同以及存在差異的OTU進(jìn)行了分析,OTU分類(lèi)結(jié)果顯示,ASD-M+C與H-M+C相比,腸道菌群結(jié)構(gòu)特征顯著不同。結(jié)果顯示費(fèi)氏刺骨魚(yú)菌(Epulopiscium)、鞘脂菌屬(Sphingobium xenophagum)、厭氧原體屬(Anaeroplasma)、Adlercreutzia、Solirubrobacterales、中慢生根瘤菌屬(Mesorhizobium)、嗜氫菌屬(Hydrogenophilus)、鹽水球菌屬(Salinicoccus)及原孢子科(Promicromonosporaceae)僅在ASD-C腸道菌群中發(fā)現(xiàn)。擬桿菌屬(Bacteroides ovatus)、乏養(yǎng)菌屬(Abiotrophia)在H-M+C組腸道菌群中發(fā)現(xiàn)。由于ASD-C和H-C的腸道菌群具有顯著的差異,我們進(jìn)一步尋找可以區(qū)分兩者的細(xì)菌生物標(biāo)志物。根據(jù)嚴(yán)格的篩選標(biāo)準(zhǔn):P值0.1且LEfSe分析中LDA值3,篩選出了 96個(gè)顯著差異的OTUs。篩選的生物標(biāo)志物可用來(lái)預(yù)測(cè)ASD疾病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。ASD-C及H-C兩組間發(fā)現(xiàn)了 5個(gè)細(xì)菌生物標(biāo)志物:β-變形菌綱(Betaproteobacteria)、伯克氏菌目(Burkholderiales)、假單胞菌目(Pseudomonadales)、莫拉菌科(Moraxellaceae)及魯氏不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)。ASD-M與H-M兩組間發(fā)現(xiàn)6個(gè)細(xì)菌生物標(biāo)志物:黃桿菌科(Flavobacteriia)、γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria)、黃桿菌目(Flavobacteriales)、周蕨科(Weksellaceae)、腸桿菌科(Enterobacteriaceae)及腸桿菌目(Enterobacteriales)。為了進(jìn)一步探索這些細(xì)菌生物標(biāo)志物在ASD-C及H-C水平、ASD-M及H-M水平的潛在價(jià)值,根據(jù)生物標(biāo)志物,我們構(gòu)建了 ROC曲線并計(jì)算AUC值,對(duì)于ASD-C及H-C,AUC值高達(dá)0.944(4倍,95%置信區(qū)間(CI):84%-100%),敏感性為83.33%,特異性為91.67%。對(duì)于ASD-M及H-M,AUC值高達(dá)0.986(4倍和5倍,95%CI:94%-100%),具有100%的敏感性和100%的特異性。進(jìn)一步評(píng)估發(fā)現(xiàn)年齡、性別和胃腸道癥狀對(duì)ASD-C和H-C的5個(gè)候選生物標(biāo)志物、ASD-M和H-M的6個(gè)候選生物標(biāo)志物均沒(méi)有顯著影響。研究結(jié)論:1.孤獨(dú)癥兒童的腸道菌群與健康兒童相比有顯著差異,且存在潛在致病菌;2.孤獨(dú)癥兒童母親與健康兒童母親的腸道菌群群落結(jié)構(gòu)也存在顯著的差異;3.孤獨(dú)癥兒童與其母親的腸道微生物群譜之間存在明顯的相關(guān)性;4.孤獨(dú)癥兒童腸道菌群有獨(dú)特的細(xì)菌生物標(biāo)志物;5.所發(fā)現(xiàn)的細(xì)菌生物標(biāo)志物具有潛在的孤獨(dú)癥風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估價(jià)值。
【圖文】：

圖１基于ＯＴＵ構(gòu)建ａ多樣性和相對(duì)豐度圖（門(mén)水平）逡逑圖Ａ、Ｂ、Ｃ顯不基于ａ多樣性中ＰＤ＿ｗｈｏｌｅ＿ｔｒｅｅ指數(shù)做的箱線圖，經(jīng)Ｗｉｌｃｏｘｏｎ秩逡逑和檢驗(yàn)計(jì)算Ｐ值表明兩組間的差異性是否顯著。逡逑圖Ｄ、Ｅ、Ｆ顯示不同組別間的門(mén)級(jí)水平間菌群相對(duì)豐度的差異。逡逑

圖２邋ＡＳＤ兒童和健康對(duì)照之間腸道菌群多樣性和相對(duì)豐度分析圖逡逑Ａ、Ｂ、Ｃ三個(gè)圖是不同分組間腸道菌群香農(nóng)指數(shù)比較。逡逑Ｄ、Ｅ、Ｆ三個(gè)圖是不同分組間腸道菌群ＡＣＥ指數(shù)比較。逡逑
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：R749.94

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5 樂(lè)t帕，

本文編號(hào)：2710375