發(fā)布時(shí)間：2020-06-13 00:40

【摘要】：第一部分銅綠假單胞菌生物膜對(duì)中性粒細(xì)胞免疫逃逸及機(jī)制研究目的:由于機(jī)械通氣在新生兒的廣泛應(yīng)用和氣管導(dǎo)管(Endotracheal tube,ETT)極易形成細(xì)菌生物膜(biofilm,BF),其所并發(fā)的呼吸機(jī)相關(guān)性肺炎依舊是目前臨床上比較棘手的問(wèn)題。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),銅綠假單胞菌(P.aeruginosa)是新生兒ETT表面最常見(jiàn)的細(xì)菌之一,P.aeruginosa在ETT又極易形成BF,且國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn),中性粒細(xì)胞(polymorphonuclears,PMNs)與P.aeruginosa BF在體內(nèi)的形成、發(fā)展以及致病性都有密切關(guān)系,但其對(duì)黏液型P.aeruginosa BF的作用及機(jī)制尚不清楚。因此,本研究的目的在于探討活化的PMNs及其氧化爆發(fā)的主要產(chǎn)物H_2O_2對(duì)黏液型P.aeruginosa FRD1 BF的影響及其機(jī)制。方法:將黏液型P.aeruginosa FRD1 BF培養(yǎng)分為FRD1組(對(duì)照組)、FRD1+PMNs組、FRD1+1 mM H_2O_2組和FRD1+2 mM H_2O_2組,分別用ddH_2O、PMNs、1 mM H_2O_2、2 mM H_2O_2處理FRD1生物膜。結(jié)晶紫、稀釋平板計(jì)數(shù)觀察PMNs或者H_2O_2對(duì)黏液型P.aeruginosa的細(xì)菌黏附能力的影響;稀釋平板計(jì)數(shù)、激光共聚焦(CLSM)觀察PMNs或者H_2O_2對(duì)黏液型P.aeruginosa BF形成的影響;稀釋平板計(jì)數(shù)、激光共聚焦(CLSM)觀察PMNs或者H_2O_2對(duì)黏液型P.aeruginosa成熟BF的影響;鹽酸硼酸法觀察PMNs或者H_2O_2對(duì)黏液型P.aeruginosa BF胞外基質(zhì)藻酸鹽的影響;RT-PCR檢測(cè)藻酸鹽相關(guān)基因algD、algR、algU的表達(dá);觀察PMNs或者H_2O_2對(duì)黏液型P.aeruginosa BF胞外基質(zhì)藻酸鹽相關(guān)基因的影響。結(jié)果:實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示PMNs或者H_2O_2能增強(qiáng)黏液型P.aeruginosa細(xì)菌的黏附能力(P0.05)和BF的形成(P0.05)。PMNs或者H_2O_2處理組的BF內(nèi)活菌數(shù)和BF厚度均明顯高于FRD1單獨(dú)組(P0.05)。與FRD1單獨(dú)組比較,PMNs或者H_2O_2處理組的BF藻酸鹽含量明顯增加(P0.05),且藻酸鹽相關(guān)基因algD、algR、algU的表達(dá)也不同程度的增加。結(jié)論:PMNs作為機(jī)體抵抗細(xì)菌感染的主要固有免疫細(xì)胞之一,活化的PMNs或者其活化后的主要產(chǎn)物之一H_2O_2不但不能清除黏液型P.aeruginosa BF,反而能增強(qiáng)黏液型P.aeruginosa FRD1的黏附能力和BF的形成,也能促進(jìn)黏液型P.aeruginosa BF胞外基質(zhì)藻酸鹽的產(chǎn)生以及藻酸鹽相關(guān)基因的表達(dá),從而增強(qiáng)細(xì)菌對(duì)機(jī)體固有免疫的逃逸作用。這可能是黏液型P.aeruginosa BF持續(xù)慢性感染的原因之一,以阻斷PMNs持續(xù)的活化為靶點(diǎn)將成為控制黏液型P.aeruginosa BF感染新的思路。第二部分野生型銅綠假單胞菌生物膜對(duì)單核巨噬細(xì)胞的免疫逃逸及機(jī)制研究目的:第一部分已經(jīng)證實(shí)黏液型P.aeruginosa能夠利用活化的PMNs或者其活化的主要產(chǎn)物H2O2增強(qiáng)自身的黏附能力和BF的形成,從而增強(qiáng)自己對(duì)機(jī)體固有免疫細(xì)胞的免疫逃逸作用。固有免疫細(xì)胞是機(jī)體抵御細(xì)菌感染的第一道防線,其中PMNs和單核巨噬細(xì)胞是固有免疫細(xì)胞中最主要的兩種細(xì)胞。有研究表明,P.aeruginosa浮游細(xì)菌能使機(jī)體單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生炎癥小體,從而降低機(jī)體對(duì)細(xì)菌的清除能力。那么,P.aeruginosa BF能否引起單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生炎癥小體,從而達(dá)到對(duì)機(jī)體的免疫逃逸作用呢?其具體機(jī)制又是怎樣的呢?這將是本部分實(shí)驗(yàn)將闡述的問(wèn)題。方法:將單核巨噬細(xì)胞分為THP-1組(對(duì)照組)、THP-1+PAO1組、THP-1+PAO1 BF組。RT-PCR檢測(cè)THP-1細(xì)胞炎癥因子IL-1β、IL-18的基因轉(zhuǎn)錄情況。RT-PCR檢測(cè)THP-1細(xì)胞相關(guān)通路中關(guān)鍵蛋白NLRC4、NLRP3、Caspase-1、Caspase-4的基因轉(zhuǎn)錄情況。ELISA法檢測(cè)THP-1細(xì)胞炎癥因子IL-1β、IL-18的表達(dá)。Western blot檢測(cè)THP-1細(xì)胞相關(guān)通路中關(guān)鍵蛋白Caspase-1、Caspase-4、Caspase-1p20、Caspase-4 p20的表達(dá)情況。結(jié)果:與PAO1浮游細(xì)菌組相比,野生型P.aeruginosa PAO1 BF處理組的THP-1細(xì)胞IL-1βm RNA轉(zhuǎn)錄顯著增加(P0.05),但I(xiàn)L-18 m RNA轉(zhuǎn)錄均沒(méi)有明顯改變。PAO1 BF促使THP-1細(xì)胞產(chǎn)生炎癥因子IL-1β和IL-18(P0.05)。與THP-1組相比,THP-1+PAO1 BF組的IL-1β、IL-18的基因轉(zhuǎn)錄明顯增加(P0.05),且相關(guān)通路中關(guān)鍵蛋白NLRP3、Caspase-1、Caspase-4的基因轉(zhuǎn)錄顯著提高(P0.05),但NLRC4基因轉(zhuǎn)錄受抑制。PAO1 BF組與對(duì)照組相比caspase-1、caspase-4前體蛋白表達(dá)量均有所增加,且活化片段caspase-1 p20、caspase-4 p20的表達(dá)量也明顯增加(P0.05)。結(jié)論:野生型P.aeruginosa BF可以使單核巨噬細(xì)胞THP-1的Caspase-1活化,從而產(chǎn)生炎癥因子IL-1β和IL-18。在野生型P.aeruginosa BF刺激下,單核巨噬細(xì)胞THP-1中NLRP3、Caspase-4表達(dá)增加,但是NLRC4表達(dá)受抑制,這說(shuō)明PAO1 BF可能是通過(guò)Caspase-4刺激炎癥小體NLRP3引起Caspase-1活化而激活細(xì)胞產(chǎn)生IL-1β和IL-18,而不是通過(guò)傳統(tǒng)的NLRC4炎癥小體引起的細(xì)胞產(chǎn)生IL-1β和IL-18。第三部分黏液型銅綠假單胞菌生物膜對(duì)單核巨噬細(xì)胞免疫逃逸及機(jī)制研究目的:第二部分已經(jīng)證實(shí)了野生型P.aeruginosa BF使單核巨噬細(xì)胞THP-1產(chǎn)生細(xì)胞因子IL-1β和IL-18,且可能是通過(guò)Caspase-4激活NLRP3炎癥小體從而引起Caspase-1活化。臨床上,由于P.aeruginosa BF的持續(xù)慢性感染,野生型P.aeruginosa很容易突變?yōu)轲ひ盒蚉.aeruginosa,且其BF的主要胞外基質(zhì)為藻酸鹽。那么,黏液型P.aeruginosa以及其主要胞外基質(zhì)藻酸鹽能否引起單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生炎癥小體,從而引起IL-1β和IL-18的分泌增加呢?方法:將單核巨噬細(xì)胞分為THP-1組(對(duì)照組)、THP-1+FRD1BF組、THP-1+藻酸鹽組。RT-PCR檢測(cè)THP-1細(xì)胞炎癥因子IL-1β、IL-18的基因轉(zhuǎn)錄情況。RT-PCR檢測(cè)THP-1細(xì)胞相關(guān)通路中關(guān)鍵蛋白NLRC4、NLRP3、Caspase-1、Caspase-4的基因轉(zhuǎn)錄情況。ELISA法檢測(cè)THP-1細(xì)胞產(chǎn)生炎癥因子IL-1β、IL-18的表達(dá)。Western blot法檢測(cè)THP-1細(xì)胞相關(guān)通路中關(guān)鍵蛋白Caspase-1、Caspase-4、Caspase-1 p20、Caspase-4 p20的表達(dá)情況。結(jié)果:黏液型P.aeruginosa BF及藻酸鹽均能使單核巨噬細(xì)胞THP-1發(fā)生皺縮,促使THP-1細(xì)胞產(chǎn)生炎癥因子IL-1β和IL-18(P0.05),且與野生型P.aeruginosa BF相比,黏液型P.aeruginosa BF使單核巨噬細(xì)胞THP-1產(chǎn)生IL-1β和IL-18更多(P0.05)。與THP-1組相比,THP-1+FRD1 BF組的IL-1β、IL-18的基因轉(zhuǎn)錄明顯增加(P0.05),且相關(guān)通路中關(guān)鍵蛋白NLRP3、Caspase-1、Caspase-4的基因轉(zhuǎn)錄顯著提高(P0.05),進(jìn)一步用western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)與THP-1組相比,THP-1+FRD1 BF組Caspase-1、Caspase-4前體蛋白表達(dá)增加,且其活化片段Caspase-1 p20、Caspase-4p20也表達(dá)明顯增加。THP-1+藻酸鹽組也能觀察到類似的趨勢(shì)。結(jié)論:黏液型P.aeruginosa FRD1 BF能使單核巨噬細(xì)胞THP-1的Caspase-1活化,從而產(chǎn)生炎癥因子IL-1β和IL-18。在黏液型P.aeruginosa BF刺激下,單核巨噬細(xì)胞THP-1中NLRP3、Caspase-4表達(dá)增加,這說(shuō)明FRD1 BF可能也是通過(guò)Caspase-4激活NLRP3炎癥小體,從而引起Caspase-1活化。BF主要胞外基質(zhì)藻酸鹽也能引起單核巨噬細(xì)胞THP-1產(chǎn)生類似的反應(yīng)。
【圖文】：

圖 1 PMNs 或者 H2O2對(duì)黏液型銅綠假單胞菌 FRD1 黏附能力的影響Fig. 1. Effect of PMNs or H2O2on the adhesion of mucoid P. aeruginosa FRD1.*P<0.05 vs 對(duì)照組（control group）3.2 PMNs 或者 H2O2對(duì) FRD1 BF 形成的影響平板計(jì)數(shù)法結(jié)果提示活化的 PMNs 對(duì) BF 有促進(jìn)作用，在活化的 PMNs 處理FRD1 BF 24 小時(shí)或者 48 小時(shí)以后，早期 BF（圖 2A）或者成熟 BF（圖 2B）的活菌量均明顯高于對(duì)照組（P<0.05）。激光共聚焦顯微鏡（CLSM）也證實(shí)了PMNs 對(duì) BF 有促進(jìn)作用，活化的 PMNs 處理早期 FRD1 BF 24 小時(shí)后，BF 厚度明顯高于對(duì)照組（圖 3A）（P<0.05），但是活化的 PMNs 處理早期 FRD1 BF 48小時(shí)后，BF 厚度稍高于對(duì)照組，，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；在活化的 PMNs 處理 FRD1

重慶醫(yī)科大學(xué)博士研究生學(xué)位論文同樣的，平板計(jì)數(shù)法結(jié)果提示 H2O2對(duì) BF 也有促進(jìn)作用，在 H2O2處理 FRD1BF 24 小時(shí)或者 48 小時(shí)以后，早期 BF（圖 2C）或者成熟 BF（圖 2D）的活菌量均明顯高于對(duì)照組（P<0.05）。激光共聚焦顯微鏡（CLSM）也證實(shí)了 H2O2對(duì)BF 有促進(jìn)作用，H2O2處理早期 FRD1 BF 或者成熟 FRD1 BF 24 小時(shí)或者 48 小時(shí)后，早期 BF（圖 3C）或者成熟 BF（圖 3D）厚度明顯高于對(duì)照組（P<0.05）。
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R722.1

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本文編號(hào)：2710354