【摘要】： 目的:天然免疫存在于所有多細胞生物,是抗御病原體感染的第一道防線。單核細胞和樹突狀細胞(dendritic cell, DC)是其中重要的效應(yīng)細胞,作為體內(nèi)重要的抗原提呈細胞(antigen present cell, APC),具有探測微生物,產(chǎn)生細胞因子,調(diào)節(jié)機體免疫反應(yīng)的能力。新生兒免疫系統(tǒng)發(fā)育不成熟,尤其是先天免疫發(fā)育不健全,調(diào)節(jié)性T細胞功能不完善,Th1/Th2細胞比例失衡,免疫反應(yīng)向Th2型偏斜,易患感染性疾病和變態(tài)反應(yīng)性疾病。大量實驗證實,腸道共生菌具有促進免疫系統(tǒng)成熟的能力,可激活免疫細胞,促進免疫活性細胞分泌細胞因子,維持Th1/Th2型細胞反應(yīng)平衡,誘導(dǎo)免疫應(yīng)答或免疫耐受。本研究采用細胞培養(yǎng)技術(shù)以腸道共生菌(雙歧桿菌和大腸桿菌)為刺激物觀察新生兒臍血單核細胞和單核細胞來源的DC的形態(tài)學(xué)和免疫學(xué)變化:1.觀察雙歧桿菌和大腸桿菌刺激單核細胞所致形態(tài)學(xué)變化和產(chǎn)生細胞因子IL-10和IL-12情況,探討其對新生兒全身免疫的作用。2.觀察雙歧桿菌和大腸桿菌刺激DC后的形態(tài)學(xué)變化和產(chǎn)生IL-10和IL-12情況,探討其對新生兒局部免疫的作用。研究結(jié)論為臨床上合理應(yīng)用微生態(tài)制劑預(yù)防和治療新生兒感染性疾病和變態(tài)反應(yīng)性疾病提供重要理論依據(jù)。 方法:選取正常足月新生兒臍血20例(陰道分娩兒10例、剖宮產(chǎn)兒10例)。每份血樣均采用甲基纖維素沉降臍血紅細胞,利用Ficoll密度梯度法分離單個核細胞(cord blood monocular cells,CB-MNCs),經(jīng)貼壁培養(yǎng)獲得單核細胞。本實驗分兩部進行 1收集部分單核細胞,分為4組,分別加入熱滅活雙歧桿菌、熱滅活大腸桿菌、熱滅活雙歧桿菌+大腸桿菌和PBS液(對照組),培養(yǎng)24小時觀察單核細胞形態(tài)學(xué)變化,取培養(yǎng)上清液ELISA法檢測IL-10和IL-12p70濃度。 2向部分貼壁的單核細胞中加入粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(Granulocyte-macrophage colony stimulating factor,GM-CSF)、IL-4聯(lián)合誘導(dǎo)單核細胞生成DC,培養(yǎng)7天獲得未成熟DC,后分為4組,分別加入熱滅活雙歧桿菌、熱滅活大腸桿菌、熱滅活雙歧桿菌+大腸桿菌和PBS液(對照組)。每日倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)學(xué)變化并攝片。取培養(yǎng)上清液行ELISA檢測IL-10和IL-12p70濃度。統(tǒng)計學(xué)利用SAS 6.12版統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計計算。采用兩樣本t檢驗、配對t檢驗和卡方檢驗,結(jié)果用均數(shù)±標準差( x±s )表示,以α=0.05為檢驗顯著性標準。 結(jié)果 1雙歧桿菌、大腸桿菌刺激單核細胞后,未發(fā)現(xiàn)形態(tài)學(xué)變化。 2雙歧桿菌、大腸桿菌刺激后單核細胞存活率與對照組無顯著差異,各組存活率均90%。 3雙歧桿菌、大腸桿菌對單核細胞刺激產(chǎn)生不同反應(yīng),未加任何刺激物時可分泌少量IL-10和IL-12p70。雙歧桿菌刺激24h后,IL-10和IL-12p70分泌量明顯增高,以IL-12p70增高為著,與對照組比較均有統(tǒng)計學(xué)差別(p0.05)。大腸桿菌刺激24h后,IL-10分泌量顯著增多,與對照組和雙歧桿菌組比較均有統(tǒng)計學(xué)差別(p0.05),產(chǎn)生IL-12水平低于雙歧桿菌組(p0.05)。兩種菌聯(lián)合刺激后出現(xiàn),IL-12水平與雙歧桿菌組接近(p0.05),高于大腸桿菌組(p0.05)。IL-10水平明顯高于兩單獨刺激組(p0.05)。說明兩種菌聯(lián)合刺激使IL-12、IL-10分泌均保持較高水平。 4體外培養(yǎng)7天可得到未成熟DC,呈懸浮狀態(tài),體積明顯變大,呈多形性,邊緣呈毛茸狀,可見小的突起。雙歧桿菌和大腸桿菌刺激24小時后突起明顯增多,可見刺狀突起及多級突起,并得到有典型樹突狀突起的成熟DC,較對照組有明顯差別。 5雙歧桿菌、大腸桿菌刺激對DC的存活率與對照組無顯著差異,各組存活率均90%。 6未成熟DC在未加任何刺激物時可分泌少量IL-10和IL-12p70,雙歧桿菌刺激24h后,IL-10和IL-12p70分泌量有所增加,與對照組比較均有統(tǒng)計學(xué)差別(p0.05),以IL-10增加顯著。大腸桿菌刺激后,IL-10分泌量顯著增多,高于對照組和雙歧桿菌組(p0.05),IL-12水平較對照組增高(p0.05),與雙歧桿菌組相似(p0.05)。兩種菌聯(lián)合刺激后則出現(xiàn),IL-12的水平有所增加,與對照組比較有統(tǒng)計學(xué)差別(p0.05),與雙歧桿菌組相似(p0.05),低于大腸桿菌組(p0.05)。但IL-10水平增高明顯,均高于對照組和兩單獨刺激組(p0.05)。 結(jié)論 1證實了體外分離、培養(yǎng)足月新生兒臍血單核細胞和單核細胞來源的樹突狀細胞的技術(shù)是成熟和成功的。 2雙歧桿菌通過促使新生兒單核細胞分泌IL-12,使免疫反向Th1方向發(fā)展,調(diào)節(jié)Th1/Th2免疫應(yīng)答平衡,激活新生兒免疫功能,增強機體抗感染能力,降低變態(tài)反應(yīng)性疾病的發(fā)生。 3雙歧桿菌、大腸桿菌通過促使樹突狀細胞分泌IL-10,誘導(dǎo)口服耐受,維持腸道自穩(wěn)狀態(tài),并促使sIgA、IgM等抗體生成,抑制變態(tài)反應(yīng)性疾病的發(fā)生。 4雙歧桿菌、非致病性大腸桿菌作為腸道共生菌不引起機體的排斥反應(yīng),不影響單核細胞和樹突狀細胞的存活,可作為益生菌誘導(dǎo)產(chǎn)生口服免疫耐受。 5腸道共生菌能夠調(diào)節(jié)新生兒先天性和獲得性免疫,調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答平衡,增強全身和局部免疫功能,對新生兒感染性疾病和變態(tài)反應(yīng)性疾病有預(yù)防和治療作用,為臨床上早期使用微生態(tài)制劑預(yù)防和治療新生兒疾病提供了理論依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號】：R722.1

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本文編號：2706719