【摘要】：目的:新生兒缺氧缺血性腦損傷(hypoxic-ischemic brain damage,HIBD)是造成新生兒死亡和兒童永久性神經(jīng)功能障礙的常見(jiàn)原因。其發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚,因此缺乏有效的防治手段。近年研究表明AMPA谷氨酸受體在HIBD發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起重要作用。本實(shí)驗(yàn)采用新生鼠HIBD模型,應(yīng)用選擇性非競(jìng)爭(zhēng)性AMPA受體拮抗劑GYKI52466進(jìn)行干預(yù),觀(guān)察海馬CA1區(qū)神經(jīng)元數(shù)、腦白質(zhì)髓鞘堿性蛋白(myelin basic protein,MBP)、神經(jīng)絲(neurofilament,NF)蛋白表達(dá)變化,了解治療對(duì)腦中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)、還原型谷光甘肽(reduced glutathione,GSH)及細(xì)胞凋亡的影響,通過(guò)測(cè)試實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶功能認(rèn)識(shí)治療的遠(yuǎn)期效果,初步探討GYKI-52466在新生鼠HIBD中的保護(hù)作用及機(jī)制,為臨床防治新生兒缺氧缺血性腦病(hypoxic-ischemic encephalopathy HIE)尋求新的途徑。 方法:7日齡(postnatal day 7,P7)Wistar大鼠,采用Rice法建立新生鼠HIBD模型,隨機(jī)分成正常對(duì)照組、假手術(shù)組、缺氧缺血組及 GYKI-52466干預(yù)組。正常對(duì)照組用于觀(guān)察MBP、NF在正常新生鼠的表達(dá)情況,其余三組于缺氧缺血(hypoxia-ischemia,HI)后24小時(shí)(24h)、1周(1w)取腦,HE染色觀(guān)察組織病理改變,計(jì)數(shù)海馬CA1區(qū)神經(jīng)元數(shù);免疫組化、圖像分析法測(cè)雙側(cè)腦半球橫截面積之比,檢測(cè)腦組織MBP、NF表達(dá)及積分光密度值;生化法檢測(cè)各組大鼠腦組織MDA、SOD、GSH水平;TUNEL法檢測(cè)腦組織細(xì)胞凋亡;于P30用 Morris水迷宮測(cè)試大鼠學(xué)習(xí)記憶功能。 結(jié)果:(1) HI后患側(cè)腦組織橫截面積下降。HI后1w,缺氧缺血組患側(cè)與對(duì)側(cè)腦半球橫截面積之比(L:RAREA)較假手術(shù)組明顯降低(p0.001);GYKI-52466干預(yù)組L:R AREA值明顯高于缺氧缺血組(p0.001)。(2) MBP在P8無(wú)顯著表達(dá)。P11嗅束、紋狀體、胼胝體、內(nèi)囊、外囊染色陽(yáng)性,可見(jiàn)少許突起延伸至皮層。P14上訴部位表達(dá)更加豐富,前聯(lián)合出現(xiàn)染色陽(yáng)性。NF-H表達(dá)部位與MBP相似,但表達(dá)量較少。HI后1w,缺氧缺血組患側(cè)與對(duì)側(cè)腦組織MBP積分光密度之比(左側(cè):右側(cè),L:RMBP)明 WP=9 顯低于假手術(shù)組(p0.02),干預(yù)組L:RMBP高于缺氧缺血組(p0.05)。HI后及治療后NF-H表達(dá)變化趨勢(shì)與MBP相似。(3) HI后1w,缺氧缺血組CA1區(qū)神經(jīng)元數(shù)顯著降低(p0.001),干預(yù)組CA1區(qū)神經(jīng)元數(shù)較缺氧缺血組明顯增多(p0.001)。(4) 假手術(shù)組新生鼠腦中偶見(jiàn)TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞,缺氧缺血組TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著增多,GYKI-52466干預(yù)使得TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯減少(p0.01);(5) HI后24h檢測(cè),缺氧缺血組SOD活力、GSH含量明顯低于假手術(shù)組(p0.001,p0.001),MDA含量明顯高于假手術(shù)組(p0.001)。GYKI-52466干預(yù)組腦組織SOD活力、GSH含量明顯高于缺氧缺血組(p0.001,p0.005),MDA含量明顯低于缺氧缺血組(p0.001)。(6) 生后30天,缺氧缺血組大鼠的學(xué)習(xí)、記憶功能?chē)?yán)重受損,Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)逃避潛伏期(EL)較假手術(shù)組延長(zhǎng),撤除平臺(tái)后90秒內(nèi)跨越平臺(tái)次數(shù)減少(p0.001);而與缺氧缺血組相比GYKI-52466干預(yù)組大鼠的學(xué)習(xí)、記憶功能障礙明顯減輕,逃避潛伏期縮短,跨越平臺(tái)次數(shù)增加(p0.01)。 結(jié)論: 1. 7日齡Wistar大鼠,結(jié)扎一側(cè)頸總動(dòng)脈后予低氧(8%O2)2.5小時(shí),制成HIBD模型,患側(cè)腦組織可見(jiàn)梗死灶及萎縮現(xiàn)象,神經(jīng)細(xì)胞壞死、凋亡,模型成功可行。 2. HIBD新生鼠患側(cè)腦組織MBP、NF-H表達(dá)下降,CA1區(qū)神經(jīng)元數(shù)減少,反映不僅新生鼠腦灰質(zhì)對(duì)缺氧缺血敏感,腦白質(zhì)同樣對(duì)缺氧缺血損害存在敏感性。 3. GYKI-52466能減少神經(jīng)元損傷,減輕HIBD大鼠患側(cè)腦組織MBP、NF-H表達(dá)下降程度,說(shuō)明腹腔注射GYKI-52466不僅對(duì)HIBD的神經(jīng)元損害具有保護(hù)作用,也能保護(hù)少突膠質(zhì)細(xì)胞和軸突。 4. GYKI-52466治療提高患側(cè)腦組織SOD、GSH水平,降低MDA水平,減少細(xì)胞凋亡,提示GYKI-52466可能通過(guò)減輕氧化應(yīng)激、抗凋亡機(jī)制發(fā)揮腦保護(hù)作用。 5. 新生鼠HIBD后出現(xiàn)遠(yuǎn)期學(xué)習(xí)記憶功能障礙,GYKI-52466治療能顯著改善HIBD新生鼠的學(xué)習(xí)記憶功能,提示早期干預(yù)對(duì)保護(hù)遠(yuǎn)期學(xué)習(xí)記憶功能有重要價(jià)值。
【圖文】：

圖 2：縱坐標(biāo)表示 L:RMBP值，黑點(diǎn)表示各例 L:RMBP值，橫線(xiàn)表示中位數(shù)。與缺氧缺血組比較，，ap<0.02；bp<0.05。3.3 GYKI-52466 對(duì) HIBD 新生鼠腦組織 NF-H 表達(dá)的影響缺氧缺血組左側(cè)腦組織 NF-H 表達(dá)明顯減少，以外囊、紋狀體最為明顯。圖像分析儀測(cè)定左側(cè)與右側(cè)腦組織 NF-H 積分光密度值之比（L:RNF）。HI 后 1w，假手術(shù)組缺氧缺血組、干預(yù)組 L:RNF值有顯著差異（p<0.001）。缺氧缺血組 L:RNF值明顯小于假手術(shù)組（p<0.001），干預(yù)組 L:RNF值高于缺氧缺血組（p<0.05）（見(jiàn)表 1、圖 3）。表 1 HI 后 1w 雙側(cè)腦組織磷酸化 NF-H 積分光密度比值(x_±s)例數(shù) L:RNF值假手術(shù)組 6 0.990±0.010△△缺氧缺血組 6 0.475±0.106干預(yù)組 6 0.671±0.145△

圖 3： HI 后 1w 雙側(cè)腦組織 NF-H 積分光密度比值（L:RNF）與缺氧缺血組比較，△p<0.05，△△p<0.001。-52466 干預(yù)后 HIBD 新生鼠海馬 CA1 區(qū)神經(jīng)元計(jì)數(shù)的變化術(shù)組海馬有 4-5 層錐體細(xì)胞，排列整齊緊密；高倍鏡下神經(jīng)清晰可見(jiàn)，形同“鷹眼”。缺氧缺血組神經(jīng)元明顯減少，失亂，神經(jīng)元胞體縮小或脫失，胞漿嗜酸性，胞核固縮或溶解組患側(cè)海馬 CA1 區(qū)細(xì)胞膜和核膜完整、核仁清楚的存活神組，GYKI-52466 干預(yù)組 CA1 區(qū)神經(jīng)元數(shù)較缺氧缺血組明2、圖 4）。表 2 HI 后 1w 患側(cè)海馬 CA1 區(qū)神經(jīng)元計(jì)數(shù) (x_±s)例數(shù) CA1 區(qū)神經(jīng)元數(shù)（個(gè)/毫米）0假手術(shù)組 缺氧缺血組 干預(yù)組
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2004
【分類(lèi)號(hào)】：R722.121

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本文編號(hào)：2706624