【摘要】：研究背景人體腸道的正常菌群在促進食物消化、合成蛋白質和維生素等營養(yǎng)物質、抵御外來致病菌侵入以及增強機體免疫能力等方面有著重要作用。并且,多種疾病狀態(tài)可改變腸道菌群的結構及數量,導致腸道菌群紊亂,從而誘發(fā)疾病的發(fā)生。近年來,人類微生物組已被證實與多種疾病的發(fā)病和進展有關,包括潰瘍性結腸炎[1]、哮喘[2]、特應性皮炎[3]等。隨著腦-腸-微生物軸[4]的提出,多種神經系統(tǒng)及其相關疾病如多發(fā)性硬化[5]、自閉癥[6]等也被證實收到腸道微生物的調控作用。過敏性紫癜(Henoch-Schonlein purpura,HSP)是一種自身免疫性疾病,可發(fā)生全身小血管的免疫炎性改變。發(fā)病原因和機制尚不明確,目前認為與機體的免疫炎癥反應有關。臨床表現主要包括皮膚小血管炎即紫癜,關節(jié)病變如關節(jié)腫痛,消化道病變如腹痛、消化道出血,以及腎臟病變,可呈現為腎炎或腎病改變。其中,累及腎臟的HSP病程遷延,可持續(xù)數月或數年,且長期或反復使用類固醇和免疫抑制劑可引起一系列并發(fā)癥,影響生活質量。而累及消化道的腹型HSP可在急性期出現較嚴重的臨床癥狀如消化道出血等,且非典型患兒容易誤診[7]][8]。輔助檢查無特異性診斷試驗,也導致非典型病例的診斷困難。因此,研究和分析其臨床特征和免疫學特征對于該疾病的早期診斷是具有重大意義的。同時,作為兒科常見的自身免疫性疾病之一,HSP的發(fā)病和進展是否也受到腸道菌群的調控是值得思考的。宏基因組程序的發(fā)展使得腸道與其微生物菌群之間能夠進行復雜的交互。16S rDNA可以做作為揭示生物物種的特征核酸序列,是目前研究細菌系統(tǒng)發(fā)育和分類鑒定應用最多和最合適的指標[9],是研究微生物構成的重要手段[10]。16S rRNA共包括19個區(qū)域,分為高變區(qū)域和保守區(qū)域。高變區(qū)域具有種屬特異性,而保守區(qū)域則不然。因此,16S rDNA擴增子測序通常是利用保守區(qū)設計通用引物對某個或某幾個變異區(qū)域進行PCR擴增,然后對高變區(qū)進行測序分析和菌種鑒定。在Illumina MiSeq測序平臺的基礎上擴增16S區(qū)域,并根據這些區(qū)域的特點,對物種進行注釋,并進行豐度分析,從而明確構成樣品的物種;通過多樣性分析等信息分析可進一步的發(fā)現樣品之間的差別。因此,可利用16S rDNA擴增子測序的方法來分析HSP兒童和健康兒童的腸道菌群并進行比較。同時,通過比較和分析不同臨床類型和不同病情程度HSP患兒腸道菌群的差異,可為該疾病的治療和預后估計提供一定方向。研究分為三個部分:一、不同臨床類型的過敏性紫癜兒童免疫學特征的比較和分析目的明確不同年齡組HSP兒童明確不同年齡組過敏性紫癜兒童臨床及免疫學特征的差異及其與器官累及的相關性。方法收集我院首診并住院治療的過敏性紫癜患兒共236例,于我院健康體檢兒童200例。根據年齡分為≤6歲組和6歲組;根據臨床癥狀和器官累及分為皮膚組、關節(jié)組、胃腸道組、腎臟組和混合組。對其進行外周血淋巴細胞亞群分析、免疫球蛋白和補體測定、中期因子和炎癥細胞因子測定以及維生素D水平測定并進行比較分析。結果關節(jié)癥狀更易出現在≤6歲組中的較大年齡患兒,腹痛、血尿、蛋白尿更多見于6歲組中的較大年齡患兒。6歲組患兒更易累及消化道和腎臟,累及器官數目各年齡組無差別。腹型HSP患兒血清IgA、IgG水平明顯升高;腎型患兒血清IgG、IgM、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17、TNF、IFN-γ水平明顯升高,CD3+和CD3+CD4+比例降低。血清MK水平在HSP患兒尤其累及腎臟者明顯升高,且與IL-4、IL-6、IL-17呈正相關。血清25-(OH)D3水平較低的HSP患兒更容易發(fā)生腎臟損害,且激素使用率和住院日均明顯增加。結論HSP患兒中高水平的IgA、IgG與消化道累及有關,而IgG、IgM、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17、TNF-α、IFN-γ水平升高和CD3+、CD3+CD4+比例降低與腎臟累及相關;血清MK和維生素D可作為早期診斷HSP和預測腎損害的有效指標。二、不同臨床類型的過敏性紫癜兒童腸道菌群的比較和分析目的明確腸道菌群的構成與HSP患兒的器官累及有無相關性。方法將收集的病例分為以下3組:單純皮膚型患兒即GZ1組,無消化道表現的混合型即GZ2組,有消化道表現的混合型即GZ3組,健康兒童對照組即CON組。將各組兒童的糞便樣品收集并凍存,進行基因組DNA的提取、PCR擴增、PCR產物的混樣和純化、文庫構建和上機測序,將測序數據處理后從OTUs分析、物種注釋、樣品復雜度分析、多樣品比較等方面進行信息分析。同時采集各組兒童的外周血進行淋巴細胞亞群分析、免疫球蛋白和補體測定、中期因子和炎癥細胞因子測定以及維生素D水平測定并進行比較分析。結果 GZ1、GZ2、GZ3組的物種構成序列數目較CON組低,以GZ2、GZ3組為著。在所有樣本中檢測到超過10個細菌門,四種豐度最高的細菌門是擬桿菌、厚壁菌、變形桿菌和放線菌。GZ2和GZ3組中變形桿菌的相對豐度明顯高于GZ1和CON組,而放線菌的相對豐度則有顯著降低,且GZ1組中放線菌的相對豐度低于CON組。UPGMA聚類樹和各組樣本的主成分分析顯示,同組樣本的微生物群落組成是相似的,同時與其他組別樣本的細菌門組成有明顯差別。Chaol指數曲線反映了微生物的豐富度和生物多樣性。稀釋曲線和Shannon曲線中多數樣品的曲線趨于變平坦,這表明樣品中的大多數細菌物種都被檢測到,反映了測序數據量的合理性。GZ3組血清IgA、IgG水平較CON組明顯升高,GZ2組的IgG水平也明顯升高;GZ2、GZ3組血清IL-4、IL-6、IL-10、IL-17、TNF、IFN-γ、MK水平明顯高于CON組,而CD3+比例和25-(OH)D3水平較CON組明顯降低。結論HSP兒童腸道微生物的豐度較正常兒童低,且在混合型HSP患兒中更為明顯。擬桿菌,厚壁菌,變形桿菌和放線菌為兒童腸道菌群中相對豐度最高的4種細菌門。變形桿菌和放線菌與HSP的免疫炎癥反應和器官累及有關。三、不同病變程度的腹型過敏性紫癜兒童腸道菌群的比較和分析目的 明確腸道菌群的構成與腹型HSP患兒的病情程度有無相關性。方法 將收集的病例分為以下3組:無消化道出血的腹型HSP患兒組即HSP-A組,有消化道出血的腹型HSP患兒組即HSP-B組,健康兒童對照組即CON組。標本收集、實驗方法同第二部分。結果 HSP-A和HSP-B組的Tags和OTUs數目均低于CON組。HSP-A和HSP-B組各分類水平上的序列數目均低于CON組,且HSP-B組的序列數目明顯低于HSP-A組。所有樣品中超過98.0%的序列屬于4種豐度最高的細菌門,即擬桿菌、厚壁菌、變形桿菌和放線菌。HSP-B組中的擬桿菌豐度較CON組明顯增高,而其厚壁菌豐度比CON組降低;HSP-A、HSP-B組的變形桿菌豐度明顯高于CON組,放線菌豐度明顯低于CON組;HSP-B組中放線菌的相對豐度較HSP-A組降低。各組樣本腸道菌群的聚類分析和主成分分析顯示同組樣本間的腸道菌群具有較高的相似性。大多數樣品稀釋曲線趨于變平坦,表明樣品中的大多數細菌物種都被檢測到,反映了測序數據量的合理性。兩組HSP患兒的血清IgA、IgG水平較CON組升高,在HSP-B組中更明顯;HSP-B組IgE水平較CON組也有明顯升高;兩組HSP患兒CD3+比例較CON組明顯降低,HSP-B組CD3+CD4+比例明顯低于CON組;兩組HSP患兒血清IL-4、IL-6、IL-10、IL-17、TNF、IFN-γ、MK水平均明顯高于CON組,其中HSP-B組IL-4、IL-17水平明顯高于HSP-A組;血清25-(OH)D3水平在HSP-A、HSP-B組患兒中明顯低于CON組。結論腹型HSP患兒腸道微生物的豐度較正常兒童低,且病變程度越重,該差別越明顯。擬桿菌,厚壁菌,變形桿菌和放線菌為兒童腸道菌群中相對豐度最高的四種細菌門。放線菌與HSP的免疫炎癥反應和其消化道病變的程度有關。綜上所述,本研究結論如下:1.HSP患兒中高水平的IgA、IgG與消化道累及有關,IgG、IgM、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17、TNF-α、IFN-y水平升高和 CD3+、CD3+CD4+比例降低與腎臟累及相關。2.血清MK和維生素D可作為早期診斷HSP和預測腎損害的有效指標。3.HSP兒童腸道微生物的豐度較正常兒童降低,且在混合型HSP患兒和病情較重的患兒中尤為明顯。4.擬桿菌,厚壁菌,變形桿菌和放線菌為兒童腸道菌群中最豐富的4種細菌門,變形桿菌和放線菌與HSP的免疫炎癥反應和器官受累有關,且放線菌與HSP消化道病變的程度有關。
【圖文】：

圖２腸道微生物細菌門相對豐度的比較逡逑注：橫坐標是樣品名稱；縱坐標表示相對豐度，，？直方圖自上而下的顏色代表相逡逑對豐度最氋的前１０位的細菌門相對豐度的總和

圖３－１：四組兒童腸道菌群中厚壁菌的相對豐度（％）逡逑
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R725.5

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本文編號：2705727