【摘要】：研究背景人體腸道的正常菌群在促進(jìn)食物消化、合成蛋白質(zhì)和維生素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、抵御外來致病菌侵入以及增強(qiáng)機(jī)體免疫能力等方面有著重要作用。并且,多種疾病狀態(tài)可改變腸道菌群的結(jié)構(gòu)及數(shù)量,導(dǎo)致腸道菌群紊亂,從而誘發(fā)疾病的發(fā)生。近年來,人類微生物組已被證實(shí)與多種疾病的發(fā)病和進(jìn)展有關(guān),包括潰瘍性結(jié)腸炎[1]、哮喘[2]、特應(yīng)性皮炎[3]等。隨著腦-腸-微生物軸[4]的提出,多種神經(jīng)系統(tǒng)及其相關(guān)疾病如多發(fā)性硬化[5]、自閉癥[6]等也被證實(shí)收到腸道微生物的調(diào)控作用。過敏性紫癜(Henoch-Schonlein purpura,HSP)是一種自身免疫性疾病,可發(fā)生全身小血管的免疫炎性改變。發(fā)病原因和機(jī)制尚不明確,目前認(rèn)為與機(jī)體的免疫炎癥反應(yīng)有關(guān)。臨床表現(xiàn)主要包括皮膚小血管炎即紫癜,關(guān)節(jié)病變?nèi)珀P(guān)節(jié)腫痛,消化道病變?nèi)绺雇�、消化道出�?以及腎臟病變,可呈現(xiàn)為腎炎或腎病改變。其中,累及腎臟的HSP病程遷延,可持續(xù)數(shù)月或數(shù)年,且長(zhǎng)期或反復(fù)使用類固醇和免疫抑制劑可引起一系列并發(fā)癥,影響生活質(zhì)量。而累及消化道的腹型HSP可在急性期出現(xiàn)較嚴(yán)重的臨床癥狀如消化道出血等,且非典型患兒容易誤診[7]][8]。輔助檢查無(wú)特異性診斷試驗(yàn),也導(dǎo)致非典型病例的診斷困難。因此,研究和分析其臨床特征和免疫學(xué)特征對(duì)于該疾病的早期診斷是具有重大意義的。同時(shí),作為兒科常見的自身免疫性疾病之一,HSP的發(fā)病和進(jìn)展是否也受到腸道菌群的調(diào)控是值得思考的。宏基因組程序的發(fā)展使得腸道與其微生物菌群之間能夠進(jìn)行復(fù)雜的交互。16S rDNA可以做作為揭示生物物種的特征核酸序列,是目前研究細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育和分類鑒定應(yīng)用最多和最合適的指標(biāo)[9],是研究微生物構(gòu)成的重要手段[10]。16S rRNA共包括19個(gè)區(qū)域,分為高變區(qū)域和保守區(qū)域。高變區(qū)域具有種屬特異性,而保守區(qū)域則不然。因此,16S rDNA擴(kuò)增子測(cè)序通常是利用保守區(qū)設(shè)計(jì)通用引物對(duì)某個(gè)或某幾個(gè)變異區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增,然后對(duì)高變區(qū)進(jìn)行測(cè)序分析和菌種鑒定。在Illumina MiSeq測(cè)序平臺(tái)的基礎(chǔ)上擴(kuò)增16S區(qū)域,并根據(jù)這些區(qū)域的特點(diǎn),對(duì)物種進(jìn)行注釋,并進(jìn)行豐度分析,從而明確構(gòu)成樣品的物種;通過多樣性分析等信息分析可進(jìn)一步的發(fā)現(xiàn)樣品之間的差別。因此,可利用16S rDNA擴(kuò)增子測(cè)序的方法來分析HSP兒童和健康兒童的腸道菌群并進(jìn)行比較。同時(shí),通過比較和分析不同臨床類型和不同病情程度HSP患兒腸道菌群的差異,可為該疾病的治療和預(yù)后估計(jì)提供一定方向。研究分為三個(gè)部分:一、不同臨床類型的過敏性紫癜兒童免疫學(xué)特征的比較和分析目的明確不同年齡組HSP兒童明確不同年齡組過敏性紫癜兒童臨床及免疫學(xué)特征的差異及其與器官累及的相關(guān)性。方法收集我院首診并住院治療的過敏性紫癜患兒共236例,于我院健康體檢兒童200例。根據(jù)年齡分為≤6歲組和6歲組;根據(jù)臨床癥狀和器官累及分為皮膚組、關(guān)節(jié)組、胃腸道組、腎臟組和混合組。對(duì)其進(jìn)行外周血淋巴細(xì)胞亞群分析、免疫球蛋白和補(bǔ)體測(cè)定、中期因子和炎癥細(xì)胞因子測(cè)定以及維生素D水平測(cè)定并進(jìn)行比較分析。結(jié)果關(guān)節(jié)癥狀更易出現(xiàn)在≤6歲組中的較大年齡患兒,腹痛、血尿、蛋白尿更多見于6歲組中的較大年齡患兒。6歲組患兒更易累及消化道和腎臟,累及器官數(shù)目各年齡組無(wú)差別。腹型HSP患兒血清IgA、IgG水平明顯升高;腎型患兒血清IgG、IgM、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17、TNF、IFN-γ水平明顯升高,CD3+和CD3+CD4+比例降低。血清MK水平在HSP患兒尤其累及腎臟者明顯升高,且與IL-4、IL-6、IL-17呈正相關(guān)。血清25-(OH)D3水平較低的HSP患兒更容易發(fā)生腎臟損害,且激素使用率和住院日均明顯增加。結(jié)論HSP患兒中高水平的IgA、IgG與消化道累及有關(guān),而IgG、IgM、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17、TNF-α、IFN-γ水平升高和CD3+、CD3+CD4+比例降低與腎臟累及相關(guān);血清MK和維生素D可作為早期診斷HSP和預(yù)測(cè)腎損害的有效指標(biāo)。二、不同臨床類型的過敏性紫癜兒童腸道菌群的比較和分析目的明確腸道菌群的構(gòu)成與HSP患兒的器官累及有無(wú)相關(guān)性。方法將收集的病例分為以下3組:單純皮膚型患兒即GZ1組,無(wú)消化道表現(xiàn)的混合型即GZ2組,有消化道表現(xiàn)的混合型即GZ3組,健康兒童對(duì)照組即CON組。將各組兒童的糞便樣品收集并凍存,進(jìn)行基因組DNA的提取、PCR擴(kuò)增、PCR產(chǎn)物的混樣和純化、文庫(kù)構(gòu)建和上機(jī)測(cè)序,將測(cè)序數(shù)據(jù)處理后從OTUs分析、物種注釋、樣品復(fù)雜度分析、多樣品比較等方面進(jìn)行信息分析。同時(shí)采集各組兒童的外周血進(jìn)行淋巴細(xì)胞亞群分析、免疫球蛋白和補(bǔ)體測(cè)定、中期因子和炎癥細(xì)胞因子測(cè)定以及維生素D水平測(cè)定并進(jìn)行比較分析。結(jié)果 GZ1、GZ2、GZ3組的物種構(gòu)成序列數(shù)目較CON組低,以GZ2、GZ3組為著。在所有樣本中檢測(cè)到超過10個(gè)細(xì)菌門,四種豐度最高的細(xì)菌門是擬桿菌、厚壁菌、變形桿菌和放線菌。GZ2和GZ3組中變形桿菌的相對(duì)豐度明顯高于GZ1和CON組,而放線菌的相對(duì)豐度則有顯著降低,且GZ1組中放線菌的相對(duì)豐度低于CON組。UPGMA聚類樹和各組樣本的主成分分析顯示,同組樣本的微生物群落組成是相似的,同時(shí)與其他組別樣本的細(xì)菌門組成有明顯差別。Chaol指數(shù)曲線反映了微生物的豐富度和生物多樣性。稀釋曲線和Shannon曲線中多數(shù)樣品的曲線趨于變平坦,這表明樣品中的大多數(shù)細(xì)菌物種都被檢測(cè)到,反映了測(cè)序數(shù)據(jù)量的合理性。GZ3組血清IgA、IgG水平較CON組明顯升高,GZ2組的IgG水平也明顯升高;GZ2、GZ3組血清IL-4、IL-6、IL-10、IL-17、TNF、IFN-γ、MK水平明顯高于CON組,而CD3+比例和25-(OH)D3水平較CON組明顯降低。結(jié)論HSP兒童腸道微生物的豐度較正常兒童低,且在混合型HSP患兒中更為明顯。擬桿菌,厚壁菌,變形桿菌和放線菌為兒童腸道菌群中相對(duì)豐度最高的4種細(xì)菌門。變形桿菌和放線菌與HSP的免疫炎癥反應(yīng)和器官累及有關(guān)。三、不同病變程度的腹型過敏性紫癜兒童腸道菌群的比較和分析目的 明確腸道菌群的構(gòu)成與腹型HSP患兒的病情程度有無(wú)相關(guān)性。方法 將收集的病例分為以下3組:無(wú)消化道出血的腹型HSP患兒組即HSP-A組,有消化道出血的腹型HSP患兒組即HSP-B組,健康兒童對(duì)照組即CON組。標(biāo)本收集、實(shí)驗(yàn)方法同第二部分。結(jié)果 HSP-A和HSP-B組的Tags和OTUs數(shù)目均低于CON組。HSP-A和HSP-B組各分類水平上的序列數(shù)目均低于CON組,且HSP-B組的序列數(shù)目明顯低于HSP-A組。所有樣品中超過98.0%的序列屬于4種豐度最高的細(xì)菌門,即擬桿菌、厚壁菌、變形桿菌和放線菌。HSP-B組中的擬桿菌豐度較CON組明顯增高,而其厚壁菌豐度比CON組降低;HSP-A、HSP-B組的變形桿菌豐度明顯高于CON組,放線菌豐度明顯低于CON組;HSP-B組中放線菌的相對(duì)豐度較HSP-A組降低。各組樣本腸道菌群的聚類分析和主成分分析顯示同組樣本間的腸道菌群具有較高的相似性。大多數(shù)樣品稀釋曲線趨于變平坦,表明樣品中的大多數(shù)細(xì)菌物種都被檢測(cè)到,反映了測(cè)序數(shù)據(jù)量的合理性。兩組HSP患兒的血清IgA、IgG水平較CON組升高,在HSP-B組中更明顯;HSP-B組IgE水平較CON組也有明顯升高;兩組HSP患兒CD3+比例較CON組明顯降低,HSP-B組CD3+CD4+比例明顯低于CON組;兩組HSP患兒血清IL-4、IL-6、IL-10、IL-17、TNF、IFN-γ、MK水平均明顯高于CON組,其中HSP-B組IL-4、IL-17水平明顯高于HSP-A組;血清25-(OH)D3水平在HSP-A、HSP-B組患兒中明顯低于CON組。結(jié)論腹型HSP患兒腸道微生物的豐度較正常兒童低,且病變程度越重,該差別越明顯。擬桿菌,厚壁菌,變形桿菌和放線菌為兒童腸道菌群中相對(duì)豐度最高的四種細(xì)菌門。放線菌與HSP的免疫炎癥反應(yīng)和其消化道病變的程度有關(guān)。綜上所述,本研究結(jié)論如下:1.HSP患兒中高水平的IgA、IgG與消化道累及有關(guān),IgG、IgM、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17、TNF-α、IFN-y水平升高和 CD3+、CD3+CD4+比例降低與腎臟累及相關(guān)。2.血清MK和維生素D可作為早期診斷HSP和預(yù)測(cè)腎損害的有效指標(biāo)。3.HSP兒童腸道微生物的豐度較正常兒童降低,且在混合型HSP患兒和病情較重的患兒中尤為明顯。4.擬桿菌,厚壁菌,變形桿菌和放線菌為兒童腸道菌群中最豐富的4種細(xì)菌門,變形桿菌和放線菌與HSP的免疫炎癥反應(yīng)和器官受累有關(guān),且放線菌與HSP消化道病變的程度有關(guān)。
【圖文】：

圖２腸道微生物細(xì)菌門相對(duì)豐度的比較逡逑注：橫坐標(biāo)是樣品名稱；縱坐標(biāo)表示相對(duì)豐度，，？直方圖自上而下的顏色代表相逡逑對(duì)豐度最氋的前１０位的細(xì)菌門相對(duì)豐度的總和

圖３－１：四組兒童腸道菌群中厚壁菌的相對(duì)豐度（％）逡逑
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R725.5

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本文編號(hào)：2705727