【摘要】： 研究背景 近年來(lái)的流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)和實(shí)驗(yàn)研究均提示：低出生體重不僅是造成圍產(chǎn)兒死亡和發(fā)病的重要原因之一，而且還是成年后心血管疾病、糖代謝異常等代謝綜合征(metabolic syndrome, MS)的獨(dú)立發(fā)病因素。因而研究低出生體重引起成年后MS的機(jī)制，以及實(shí)施成年期疾病的早期防治已成為一個(gè)研究熱點(diǎn)。圍生期發(fā)育中的許多器官都會(huì)經(jīng)歷一個(gè)重構(gòu)(remodeling)的過(guò)程，此時(shí)期器官細(xì)胞的增殖、凋亡均處于動(dòng)態(tài)變化中，且存在干細(xì)胞的分化再生。內(nèi)分泌胰腺—胰島的發(fā)育同樣存在重構(gòu)，且已證實(shí)胎兒期和生后早期是胰島重構(gòu)的關(guān)鍵時(shí)期，此后胰島的結(jié)構(gòu)和功能已被“程序化”，對(duì)血糖的自穩(wěn)態(tài)將產(chǎn)生終生的影響。營(yíng)養(yǎng)素是基因表達(dá)的重要調(diào)節(jié)因子，它可通過(guò)控制代謝產(chǎn)物或代謝狀態(tài)導(dǎo)致mRNA、蛋白質(zhì)合成與功能改變。在胰腺發(fā)育的關(guān)鍵時(shí)期對(duì)營(yíng)養(yǎng)不良敏感，充足的營(yíng)養(yǎng)對(duì)維持發(fā)育期胰島的正常形態(tài)功能是必要的。作為一種發(fā)育期重要的必需氨基酸—�；撬�，在低出生體重兒是明顯缺乏的。有研究表明�；撬峋哂幸葝u素樣生物效應(yīng)，參與維持機(jī)體葡萄糖自穩(wěn)態(tài)；作為內(nèi)源性細(xì)胞保護(hù)劑，它還能保護(hù)胰島β細(xì)胞的內(nèi)分泌功能。但國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)有關(guān)牛磺酸對(duì)生后早期胰島重構(gòu)影響的研究。牛磺酸可促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞增殖分化；并能通過(guò)抑制巨嗜細(xì)胞內(nèi)iNOS的活性達(dá)到抑制巨嗜細(xì)胞凋亡的作用。但是關(guān)于�；撬釋�(duì)胰島細(xì)胞增值、凋亡以及再生分化影響的研究亦甚缺乏。 目的 (1)本實(shí)驗(yàn)試給予孕鼠10％低蛋白飲食，觀察所生仔鼠數(shù)目、平均體重、IUGR發(fā)生率及圍產(chǎn)期死亡率，檢驗(yàn)該方法是否適用于制造低出生體重仔鼠模型。(2)研究低出生體重仔鼠生后早期階段體重、血糖水平、血胰島素水平、胰島β細(xì)胞量(βcell mass, BCM)和β細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化。(3)進(jìn)一步從胰島細(xì)胞增殖、凋亡和分化三方面，探討�；撬釋�(duì)低出生體重仔鼠胰島重構(gòu)的影響及其有效機(jī)制。 方法 (1)低出生體重仔鼠模型的建立和實(shí)驗(yàn)分組：采用健康三月齡SD二級(jí)雌性和雄性大鼠各40只，，按照雌雄1∶1的比例同一籠中交配。將孕鼠分成四組：①給予孕期母鼠10％低蛋白飼料(R組)制造低出生體重仔鼠模型，并在21天哺乳期持續(xù)該飼料喂養(yǎng)；②對(duì)照組(C組)母鼠給予21％正常蛋白飼料喂養(yǎng)；③在21天哺乳期給予部分10％低蛋白飼料喂養(yǎng)的母鼠富含2.5％�；撬犸嬘盟M(jìn)行營(yíng)養(yǎng)干預(yù)(RT組)；④給予部分21％正常蛋白飼料喂養(yǎng)的母鼠富含2.5％牛磺酸飲用水進(jìn)行對(duì)照營(yíng)養(yǎng)干預(yù)(CT組)；其它母鼠自由飲水。觀察R和C組新生仔鼠數(shù)目、平均體重、IUGR發(fā)生率及圍產(chǎn)期死亡率。 (2)胰島功能和結(jié)構(gòu)的變化：①于生后1、7、14、21天取仔鼠稱(chēng)體重、取血測(cè)血糖和胰島素值。②并取出胰腺備做電鏡標(biāo)本，電鏡下觀察胰島β細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)。③免疫組化方法檢測(cè)胰島素(insulin)蛋白在胰腺中的表達(dá)，并計(jì)算β細(xì)胞量(BCM=胰島素陽(yáng)性面積／胰腺總面積×胰腺重量)。 (3)牛磺酸干預(yù)后胰島重構(gòu)相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)：①免疫組化方法檢測(cè)BrdU在胰島中的表達(dá)，計(jì)算增殖指數(shù)(proliferation index, PI)；②末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記法(TUNEL)檢測(cè)胰島細(xì)胞凋亡情況，計(jì)算凋亡指數(shù)(apoptosis index, AI)；③RT-PCR方法檢測(cè)胰腺組織insulin和胰十二指腸同源盒基因-1(PDX-1)mRNA表達(dá)量。采用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。多個(gè)樣本均數(shù)間的兩兩比較采用單因素方差分析中的最小顯著差異法(LSD)，P＜0.05視為差異有顯著性。 結(jié)果 (1)建立低出生體重仔鼠模型：10％低蛋白飼料喂養(yǎng)孕鼠，可使其仔鼠出生體重下降，且較多達(dá)到IUGR標(biāo)準(zhǔn)；而每窩產(chǎn)仔數(shù)和圍生期死亡率無(wú)明顯變化。 (2)胰島功能和結(jié)構(gòu)的變化：①各組各時(shí)間點(diǎn)的血糖和胰島素水平無(wú)顯著性差異。②各組仔鼠的胰島BCM均隨日齡增加而增加；R組仔鼠各時(shí)間點(diǎn)的BCM均顯著低于于C組。③生后1天時(shí)，R組整個(gè)胰腺組織中β細(xì)胞少見(jiàn)；β細(xì)胞的內(nèi)分泌顆粒分布不均勻結(jié)構(gòu)不完整；生后21天時(shí)，R組仔鼠β細(xì)胞中內(nèi)分泌顆粒的大小和分布不如C組均勻，且可見(jiàn)較多蒼白顆粒和脫顆粒現(xiàn)象。 (3)牛磺酸干預(yù)后胰島重構(gòu)相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)：①經(jīng)生后給予�；撬幔琑T組于生后7、14、21天出現(xiàn)輕微的生長(zhǎng)追趕現(xiàn)象。②經(jīng)生后早期補(bǔ)充�；撬�，21天時(shí)RT組β細(xì)胞中內(nèi)分泌顆粒的大小和分布較R組均勻，蒼白顆粒和脫顆粒現(xiàn)象較R組也少見(jiàn)，但仍未恢復(fù)至C組正常形態(tài)；CT組與C組的超微結(jié)構(gòu)相似。③各組仔鼠的胰島insulin mRNA表達(dá)和BCM均隨日齡增加而增加；RT組仔鼠各時(shí)間點(diǎn)的insulin mRNA和BCM均顯著高于R組，接近C組和CT組。④各組仔鼠的胰島細(xì)胞PI均隨日齡增加而下降；RT組PI均顯著高于R組，接近C組和CT組水平。⑤各組仔鼠的胰島細(xì)胞AI在生后21天內(nèi)經(jīng)歷了動(dòng)態(tài)變化，RT組的AI較R組下降，但仍高于C和CT組。⑥各組仔鼠的胰腺PDX-1 mRNA表達(dá)均隨日齡增加而下降；RT組仔鼠各時(shí)間點(diǎn)的PDX-1 mRNA表達(dá)均顯著高于R組，接近C組和CT組水平。 結(jié)論 (1)10％低蛋白飼料喂養(yǎng)孕鼠，是一種有效的制造低出生體重仔鼠模型的方法。(2)生后21天內(nèi)，低出生體重仔鼠尚未出現(xiàn)血糖和胰島素異常，但是胰島結(jié)構(gòu)已發(fā)生變化(包括BCM下降和β細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變)。(3)生后早期補(bǔ)充�；撬嵛磳�(duì)低出生體重仔鼠的生長(zhǎng)追趕起顯著作用；但可以通過(guò)減緩胰島細(xì)胞增殖下降的趨勢(shì)、減少胰島細(xì)胞凋亡和促進(jìn)β細(xì)胞的定向分化三方面機(jī)制，增加低出生體重仔鼠的胰島BCM，最終達(dá)到改善胰島重構(gòu)的效應(yīng)。
【圖文】：

圖1一1:新生鼠的胰腺解剖結(jié)構(gòu)圖Figurel一l:AnatomicaleonfigurationofPanereasinneonatalrat1一肝臟;2一小腸;3一胃;4一胰腺;5一脾臟l一1iver;2一smallintestine;3一stomaeh;4一Panereas;5一sPleen、檢測(cè)內(nèi)容及方法:(一)、體重和胰腺重量:禁食1小時(shí)后稱(chēng)體重，解剖動(dòng)物完整分離胰記錄。(二)、血糖:禁食1小時(shí)后，用羅氏血糖儀測(cè)全血的快速血糖，并記(三)、放射免疫法(radioimmunoassa蘇RIA)檢測(cè)血胰島素水平:1、將待測(cè)血清標(biāo)本自然解凍并升至室溫，取質(zhì)控血清I、H和待測(cè)0“l(fā)于試管內(nèi)。2、用微量移液器取100pl抗血清(第一抗體)，在旋渦混合器上充分于恒溫水浴箱內(nèi)溫育(37℃溫育60分鐘)。

2、仔鼠體重:本實(shí)驗(yàn)通過(guò)母鼠低蛋白飲食法成功建立了宮內(nèi)營(yíng)養(yǎng)不良的低出生體重仔鼠模型。生后第1天時(shí)，R組仔鼠體重為6.24土0.52克，顯著低于C組仔鼠的7.68士0.41克(尸=0.002)(見(jiàn)圖1一2)。之后各組仔鼠體重雖然均逐步增加，但R組仔鼠體重始終低于C組。第21天時(shí)R組仔鼠明顯瘦小，皮毛稀疏，毛色無(wú)光澤;C組仔鼠皮毛豐密，毛色有光澤。圖1一2:生后第1天的R組和C組新生仔鼠 Figurel一 2:neonatalratsofgrouPRandCatPostnataldaylleft一 neonatalratingrouPR(Wt5.859);right一 neonatalratingrouPC(Wt7.509)3、IUGR發(fā)生率:以C組仔鼠的平均體重減兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差(即6.86克)，作為界定IUGR的標(biāo)準(zhǔn)，低于6.86克者判定為IUGR仔鼠。R組獲得的IUGR仔鼠為97只，C組獲得IUGR仔鼠僅9只。R組IUGR發(fā)生率為66.4%
【學(xué)位授予單位】：中南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2006
【分類(lèi)號(hào)】：R722

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2695540