發(fā)布時間：2020-06-03 00:23

【摘要】： 肺炎支原體(Mycoplasma pneumoniae, Mp)屬于柔膜體綱支原體科支原體屬,是有能力在體外不依靠活細胞生存、能夠進行自我復(fù)制的最小微生物之一。研究表明肺炎支原體是引起社區(qū)獲得性呼吸道感染的主要病原體之一,可引起支氣管炎和非典型肺炎。 肺炎支原體生長緩慢、培養(yǎng)周期長、體外分離培養(yǎng)比較困難,國內(nèi)開展相關(guān)研究的單位很少。但只有獲得肺炎支原體臨床株才能進一步明確其生物學(xué)特性,了解肺炎支原體對目前常用抗菌藥物的敏感性情況,進行分子流行病學(xué)研究,并開展新抗菌藥物對肺炎支原體的藥效學(xué)評價工作。 本研究建立了肺炎支原體臨床株的分離培養(yǎng)方法,并進行連續(xù)收集和保存,建立了菌種庫。采用經(jīng)改良的微量稀釋法測定藥物敏感性,對大環(huán)內(nèi)酯類耐藥株進行了耐藥機制研究和同源性分析。將Cycleave PCR技術(shù)應(yīng)用于肺炎支原體及其耐藥性的快速檢測。同時對肺炎支原體感染患兒的臨床療效進行了回顧性研究。 本部分研究建立了從臨床標(biāo)本中分離培養(yǎng)肺炎支原體的方法,分離的臨床菌株均良好保存。痰液標(biāo)本來自2005年11月-2009年7月期間上海市兒童醫(yī)院因呼吸道感染住院患兒的鼻咽部吸取物。分離培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)流程為：①呼吸道標(biāo)本直接接種于液體培養(yǎng)基；②37℃孵育觀察顏色變化；③液體培養(yǎng)基≥4天變?yōu)榍辶�、無混濁的黃色；④取100μl加入1 ml SP4液體培養(yǎng)基中,37℃孵育；⑤隔日觀察,約5-7天后可再次觀察到液體培養(yǎng)基變?yōu)榍辶恋狞S色；⑥重復(fù)上述④⑤步驟2-3次即可得到肺炎支原體純種；⑦采用PCR方法進行篩選和菌種鑒定；⑧菌種保存于-70℃及液氮中各一份。經(jīng)過近五年的分離培養(yǎng)、純化和凍存工作,我們成功分離并保存了152株肺炎支原體臨床分離株。臨床兒童呼吸道送檢標(biāo)本中肺炎支原體培養(yǎng)總檢出率約為4.8%(152/3159)。 目前仍沒有被普遍接受的支原體藥敏試驗標(biāo)準(zhǔn)方法,結(jié)果判定也尚無國際統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。更多學(xué)者傾向于采用微量稀釋法進行支原體藥物敏感性測定。文獻報道的方法是在微量孔內(nèi)進行抗菌藥物及培養(yǎng)基稀釋。我們對微量稀釋法進行改進,采用試管法先將抗菌藥物對倍稀釋后加樣至微量板,與微量板孔內(nèi)稀釋相比可增加稀釋的準(zhǔn)確性。 本研究部分采用改良的微量稀釋法測定了10種常用抗菌藥物對肺炎支原體臨床分離株的藥物敏感性。結(jié)果顯示,四環(huán)素類(四環(huán)素、多西環(huán)素、米諾環(huán)素)對肺炎支原體均具有良好的體外抗微生物活性。氟喹諾酮類中莫西沙星對肺炎支原體具有良好的體外抗微生物活性,MIC50和MIC90均為0.06 mg/L,明顯優(yōu)于環(huán)丙沙星和左氧氟沙星。肺炎支原體臨床分離株對紅霉素的敏感性低,MIC50和MIC90均128 mg/L。90.1%(137/152)臨床分離株對紅霉素耐藥,所有137株耐藥株中135株的紅霉素MIC128 mg/L,2株紅霉素MIC為64 mg/L。9.9%(15/152)的肺炎支原體臨床株對紅霉素敏感,MIC均≤0.015mg/L。肺炎支原體對阿奇霉素和克拉霉素的敏感性也明顯下降,但阿奇霉素及克拉霉素的MIC值低于紅霉素,阿奇霉素的MIC最高值為128 mg/L,無＞128 mg/L的菌株。本研究中16環(huán)大環(huán)內(nèi)酯類交沙霉素對肺炎支原體抗菌活性優(yōu)于其他大環(huán)內(nèi)酯類,MIC50和MIC90分別為4及8 mg/L。各年度肺炎支原體對紅霉素的耐藥率分別為,2005年60%(3/5),2006年82.4%(14/17),2007年100%(24/24),2008年80.8%(42/52),2009年100%(54/54)。 上述研究表明,肺炎支原體臨床分離株對大環(huán)內(nèi)酯類耐藥率高,達90%以上。對于這些耐藥菌是否存在克隆傳播,需要進行分離株間的同源性分析以進一步明確。本部分研究分別采用經(jīng)典的限制性片段長度多態(tài)性分析(RFLP)和多重位點可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列分析(MLVA)方法對肺炎支原體臨床分離株進行分型。 152株肺炎支原體臨床株除2株外均可以采用PCR-RFLP方法進行分型。92.0%(138/150)屬于P1-Ⅰ型,8.0%(12/150)屬于P1-Ⅱ型。Ⅰ型中紅霉素敏感株占5.1%(7/138),耐藥株94.9%(131/138)；而Ⅱ型中敏感株占66.7%(8/12),耐藥株占33.3%(4/12)。肺炎支原體PCR-RFLP I型的耐藥率明顯高于Ⅱ型(X2=119.47,P0.01)。采用MLVA分型方法,154株肺炎支原體(包括2株標(biāo)準(zhǔn)株)分為18種基因型(MT1-MT18),其中3個為獨特類型僅含有一個菌株,其余15種基因型含有2或2株以上菌株,稱為簇,最大的一簇含有21株肺炎支原體。簇內(nèi)菌株在基因水平上存在親緣性,具有同源性。MLVA(5位點)的分辨指數(shù)(HGI)為0.917,其中多態(tài)性較好位點的有VNTR1 (HGI 0.813, PI 0.777)和VNTR5 (HGI 0.454, PI 0.451),而其他位點分辨率較低。 以往研究顯示,肺炎支原體對大環(huán)內(nèi)酯類藥物耐藥主要與靶位改變有關(guān),其耐藥機制主要為核糖體23S rRNA V區(qū)中心環(huán)核苷酸序列改變導(dǎo)致抗生素與核糖體親和力下降而引起耐藥。A2063G突變是最常報道的突變位點,A2064G、A2063C等突變也有報道。 本部分對肺炎支原體臨床分離株對大環(huán)內(nèi)酯類的耐藥機制進行了研究。自行設(shè)計引物對肺炎支原體核糖體23S rRNA全長進行擴增,產(chǎn)物測序。結(jié)果顯示,137株紅霉素耐藥肺炎支原體臨床株均存在23S rRNA的核苷酸點突變,其中A2063G突變135株,A2064G和A2064T突變各1株,其中A2064T點突變?yōu)槭状伟l(fā)現(xiàn)。15株紅霉素敏感株均不存在23S rRNA點突變。不同的核苷酸點突變所引起的大環(huán)內(nèi)酯類耐藥水平也有不同。A2063G所引起的耐藥主要是針對14環(huán)和15環(huán)大環(huán)內(nèi)酯類,而A2064G的點突變可引起16環(huán)大環(huán)內(nèi)酯類的高水平耐藥。與標(biāo)準(zhǔn)株Mp FH (ATCC 15531)相比,所有152株臨床株均存在A1290G點突變,此點突變與耐藥無關(guān)。 肺炎支原體分離培養(yǎng)困難、藥敏試驗周期長、采用PCR擴增測序進行耐藥位點檢測耗時,因此需要研發(fā)新的快速診斷方法,以期能夠快速、同步檢測肺炎支原體感染及耐藥性。Cycleave PCR技術(shù)是一種由RNA和DNA構(gòu)成的嵌合Cycling探針與RNase H組合使用的高靈敏度Real time PCR檢測方法,是一個能檢測出單個堿基突變的高特異性方法。 本部分研究采用Cycleave PCR技術(shù)建立了可檢出肺炎支原體并鑒別其大環(huán)內(nèi)酯類耐藥突變株的方法,并成功應(yīng)用于臨床標(biāo)本的檢測。結(jié)果顯示,CycleavePCR可檢測出肺炎支原體并準(zhǔn)確區(qū)分敏感野生株和突變耐藥株,肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌、流感嗜血桿菌、肺炎克雷伯菌基因組DNA等陰性對照均呈陰性,未出現(xiàn)假陽性結(jié)果。該方法檢測帶肺炎支原體23S rRNA基因片段重組質(zhì)粒時的檢測下限可達10拷貝/PCR反應(yīng)。應(yīng)用Cycleave PCR技術(shù)檢測151株肺炎支原體臨床分離株中,15株無突變敏感株、135株A2063G突變耐藥株和1株A2064G突變耐藥株分別出現(xiàn)了與陽性對照相同的擴增結(jié)果,與常規(guī)PCR擴增及測序結(jié)果完全相符。檢測的150份痰液標(biāo)本中,25份出現(xiàn)與陽性對照相同的擴增結(jié)果,其它125份均為陰性結(jié)果,也與常規(guī)PCR擴增及測序結(jié)果完全相符。 大環(huán)內(nèi)酯類藥物是治療兒童肺炎支原體感染患者的首選藥物。近年來肺炎支原體對大環(huán)內(nèi)酯類藥物的耐藥性呈上升趨勢,是否仍然能夠使用大環(huán)內(nèi)酯類藥物治療耐藥肺炎支原體感染成為臨床醫(yī)生關(guān)心的問題。日本學(xué)者采用回顧性研究方法指出大環(huán)內(nèi)酯類耐藥肺炎支原體感染的兒童患者的臨床治療反應(yīng)較差。 本部分采用回顧性研究方法對阿奇霉素治療大環(huán)內(nèi)酯類敏感或耐藥肺炎支原體感染患兒的臨床療效進行分析比較。共收集到上海市兒童醫(yī)院2005年12月-2008年10月因呼吸道感染住院患兒病史57例,其中大環(huán)內(nèi)酯類敏感肺炎支原體感染患兒共9例,大環(huán)內(nèi)酯類耐藥肺炎支原體感染患兒48例。所有48株耐藥肺炎支原體的紅霉素MIC均128 mg/L,均存在核糖體23S rRNA A2063G點突變。所有患兒均顯示臨床有效。針對57例患兒進行的統(tǒng)計分析結(jié)果顯示,肺炎支原體對大環(huán)內(nèi)酯類是否敏感與臨床治療反應(yīng)密切相關(guān),大環(huán)內(nèi)酯類耐藥肺炎支原體感染患兒的總住院時間、大環(huán)內(nèi)酯類治療后退熱時間以及各階段發(fā)熱時間均較敏感株感染延長,其差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。為了排除混合感染對療效的影響,將合并有病毒或細菌檢測陽性的病例剔除,對剩余38例患兒再次進行統(tǒng)計分析。為進一步消除不同聯(lián)合用藥的影響,對上述38例患兒再次進行篩選,選取21例聯(lián)合使用相同抗感染治療方案的患兒(均給予阿莫西林-克拉維酸聯(lián)合阿奇霉素治療)進行統(tǒng)計分析。不同分層分析的結(jié)果均顯示,大環(huán)內(nèi)酯類耐藥肺炎支原體感染可引起總住院時間延長、阿奇霉素治療后退熱時間延長以及阿奇霉素治療后38度以上持續(xù)時間延長,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
【圖文】：

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2005一2009年各月份肺炎支原體分離率
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R725.6

【引證文獻】

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1 張闖;劉贊;;阿奇霉素治療老年肺炎支原體感染療效及安全性評價[J];當(dāng)代醫(yī)學(xué);2014年07期

本文編號：2693996