【摘要】： 前言 發(fā)育性髖關(guān)節(jié)發(fā)育不良(developmental displysia of the hip，DDH)是小兒骨科常見的髖關(guān)節(jié)發(fā)育障礙性疾病，發(fā)病率1-1.5‰，目前病因不明。以往的研究發(fā)現(xiàn)DDH患兒多伴有全身關(guān)節(jié)松弛，這與髖脫位術(shù)中所見松弛薄弱的髖關(guān)節(jié)囊與圓韌帶相符。因此髖關(guān)節(jié)松弛是導(dǎo)致髖脫位主要因素之一也得到了普便認(rèn)同。 關(guān)節(jié)過度活動或關(guān)節(jié)松弛目前認(rèn)為是一種疾病并已得到兒科及骨科醫(yī)師的重視，它可發(fā)生在單個關(guān)節(jié)或是全身性的。大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為它是由基因決定的結(jié)締組織松弛所造成的，特別是對關(guān)節(jié)囊和韌帶的影響。目前已知的3個經(jīng)典的與基因有關(guān)的膠原疾病有：1)馬凡氏綜合癥：是原纖維蛋白基因FIB 1和FIB 2的突變；2)成骨不全：有200多種獨(dú)立突變發(fā)生在COL 1a1和COL1a2；3)Ehlers-Danlos綜合癥：約有80種突變發(fā)生在COL 3a1。因此有許多學(xué)者推測DDH可能是一種發(fā)生在結(jié)締組織的可遺傳的疾病，很可能與某些細(xì)胞外基質(zhì)成分有關(guān)，如膠原、彈力纖維等。人類出生時髖臼較淺，股骨頭表面為平滑弧線，出生后髖臼不斷加深，股骨頭弧度加大，髖關(guān)節(jié)逐漸穩(wěn)定，而這需要頭臼同心的相互作用才能達(dá)到。而關(guān)節(jié)囊和圓韌帶則具有保持這種頭臼同心位置重要的作用。 膠原纖維及小分子蛋白多糖是關(guān)節(jié)囊和圓韌帶的主要成分，并發(fā)揮著重要的抗張力生物學(xué)作用。以往關(guān)于DDH關(guān)節(jié)囊及圓韌帶中膠原纖維的研究有過少量報道但結(jié)果迥異，多停留在組織形態(tài)水平。本研究以DDH患兒髖關(guān)節(jié)囊和圓韌帶為研究對象，應(yīng)用免疫組織化學(xué)法觀察Ⅰ、Ⅲ型膠原在髖關(guān)節(jié)囊和圓韌帶的分布與定位；應(yīng)用分子生物學(xué)檢測技術(shù)比較Ⅰ、Ⅲ型膠原和兩種小分子蛋白多糖(Biglycan和Decorin)在轉(zhuǎn)錄水平和(或)蛋白水平的表達(dá)差異。試圖從分子水平揭示DDH患兒髖關(guān)節(jié)松弛的機(jī)理，是關(guān)節(jié)松馳導(dǎo)致DDH理論的一次深入探索。 材料與方法 一、標(biāo)本采集及處理 發(fā)育性髖脫位髖關(guān)節(jié)囊標(biāo)本33例，來源方式：手術(shù)復(fù)位中經(jīng)緊縮后切除的髖關(guān)節(jié)上方多余關(guān)節(jié)囊。對照組兒童髖關(guān)節(jié)囊標(biāo)本17例。在DDH組選擇與對照組性別相同，年齡相近的9例患兒與對照組配對。 發(fā)育性髖脫位髖關(guān)節(jié)圓韌帶標(biāo)本20例，來源方式：手術(shù)復(fù)位中切除的患髖圓韌帶。對照組兒童圓韌帶標(biāo)本10例。在DDH組選擇與對照組性別相同，年齡相近的6例患兒與對照組配對。 剪取標(biāo)本為多個小組織塊：部分置于4％多聚甲醛溶液中室溫固定24小時，脫水，透明，石蠟包埋，制成5μm切片；部分置于Eppendorf管中，-80℃深低溫保存。 二、實(shí)驗方法及檢測指標(biāo) (一)免疫組織化學(xué)法(SABC法) 觀察Ⅰ、Ⅲ型膠原在DDH患兒髖關(guān)節(jié)囊及圓韌帶中的定位與分布，半定量測定Ⅰ、Ⅲ型膠原含量。 (二)髖關(guān)節(jié)囊及圓韌帶中Ⅰ、Ⅲ型膠原和兩種小分子蛋白多糖(Biglycan和Decorin)轉(zhuǎn)錄水平檢測 反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcriptionpolymerase chain reaction，RT-PCR)測定COL1a1、COL3a1、Biglycan和Decorin mRNA水平表達(dá)。 (三)髖關(guān)節(jié)囊及圓韌帶中Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白水平檢測 免疫印跡雜交技術(shù)(Western-Blot)檢測COL1a1、COL3a1蛋白水平表達(dá)。 三、統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS10.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，p＜0.05視為統(tǒng)計學(xué)上顯著差異。應(yīng)用Pearson法進(jìn)行相關(guān)分析，配對比較采用配對T檢驗。 實(shí)驗結(jié)果 一、Ⅰ、Ⅲ型膠原的定位、分布與含量 (一)關(guān)節(jié)囊 1、Ⅰ型膠原 貼近關(guān)節(jié)側(cè)的滑膜層呈強(qiáng)陽性表達(dá)，成纖維細(xì)胞及膠原纖維平行滑膜緣排列規(guī)整。纖維層陽性表達(dá)有所減弱，膠原纖維排列波浪樣、多級性，成纖維細(xì)胞散布其間。在性別相同，年齡相近的9例配對比較中，纖維層中有陽性表現(xiàn)的成纖維細(xì)胞數(shù)占總計數(shù)成纖維細(xì)胞的百分比及膠原染色的灰度值在髖脫位組與對照組間存在顯著差異(p＜0.05) 2、Ⅲ型膠原 僅在DDH組纖維層中出現(xiàn)3例大齡女性患兒陽性反應(yīng)：2例為成纖維細(xì)胞周圍出現(xiàn)環(huán)繞棕色深染；1例為細(xì)胞外基質(zhì)網(wǎng)狀棕色深染。 (二)圓韌帶 1、Ⅰ型膠原 貼近外周的圓韌帶鞘呈強(qiáng)陽性表達(dá)，膠原纖維平行滑膜緣排列規(guī)整。內(nèi)部纖維層陽性表達(dá)有所減弱，膠原纖維排列波浪樣、多極性，成纖維細(xì)胞散布其間。在性別相同，年齡相近的6例配對比較中，纖維層中有陽性表現(xiàn)的成纖維細(xì)胞數(shù)占總計數(shù)成纖維細(xì)胞的百分比及膠原染色的灰度值在DDH組與對照組間存在顯著差異(p＜0.05)。 2、Ⅲ型膠原 DDH組與對照組均未見陽性反應(yīng)。 二、Ⅰ、Ⅲ型膠原和兩種小分子蛋白多糖(Biglycan和Decorin)mRNA表達(dá)差異 (一)關(guān)節(jié)囊 COL1a1、COL3a1、Biglycan和Decorin mRNA在DDH組表達(dá)較正常對照組降低(p＜0.01)。 (二)圓韌帶 COL1a1、Biglycan和Decorin mRNA在DDH組表達(dá)較正常對照組降低(p＜0.01)。COL3a1無顯著差異(p＞0.05)。 三、Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)差異 (一)關(guān)節(jié)囊 COL1a1蛋白含量在DDH組較正常對照組降低(p＜0.01)。COL3a1無顯著差異(p＞0.05)。 (二)圓韌帶 COL1a1蛋白含量在DDH組較正常對照組降低(p＜0.01)。COL3a1無顯著差異(p＞0.05)。 結(jié)論 一、嬰兒期至青春期前DDH患兒髖關(guān)節(jié)囊及圓韌帶中旺盛分泌Ⅰ型膠原的成纖維細(xì)胞的比例較正常同性同齡兒減小，提示DDH患兒Ⅰ型膠原合成能力下降。 二、DDH患兒髖關(guān)節(jié)囊及圓韌帶中Ⅰ型膠原在mRNA及蛋白水平表達(dá)較正常同性同齡兒降低，可能是導(dǎo)致DDH患兒髖關(guān)節(jié)松弛的主要原因。 三、DDH患兒髖關(guān)節(jié)松弛可能與Ⅲ型膠原含量無關(guān)。 四、雙糖鏈蛋白多糖(Biglycan)和核心蛋白聚糖(Decorin)mRNA在DDH患兒髖關(guān)節(jié)囊及圓韌帶的表達(dá)降低，二者很可能參與DDH的髖關(guān)節(jié)松馳機(jī)制。
【圖文】：

成纖維細(xì)胞及I型膠原纖維平行滑膜緣排列規(guī)整(400x)

型膠原在兒童髓關(guān)節(jié)囊的分布，，滑膜層表達(dá)強(qiáng)于纖維層(100X)
【學(xué)位授予單位】：中國醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號】：R726.8

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本文編號：2691640