【摘要】： 前言 隨著機(jī)械通氣的廣泛開展,早產(chǎn)兒管理技術(shù)的日益提高和肺表面活性物質(zhì)的普遍應(yīng)用,早產(chǎn)兒,尤其是極低出生體重兒的存活率有了明顯提高,隨著而來因長時間吸入高濃度氧所導(dǎo)致的早產(chǎn)兒慢性肺疾病(chronic lung disease,CLD)的發(fā)生率亦在增加,嚴(yán)重影響了早產(chǎn)兒的生存質(zhì)量,是目前導(dǎo)致新生兒致殘主要疾病之一。盡管高氧致CLD的發(fā)生機(jī)制還不清楚,但有關(guān)其病理過程及病理變化已基本明確,即早期的肺水腫及晚期肺間質(zhì)纖維化,目前的多數(shù)研究試圖從拮抗肺纖維化的角度來達(dá)到目的,但效果并不理想。那么若能從CLD早期階段—肺水腫期為突破點(diǎn),探索其發(fā)生的可能機(jī)制,從而為CLD新的防治途徑的設(shè)計奠定實(shí)驗和理論基礎(chǔ)。 高氧肺損傷是一組織彌漫性肺泡炎和損傷后的修復(fù)重建的復(fù)雜病理、生理過程,其肺損傷早期特征性改變是肺水腫。目前認(rèn)為CLD早期肺水腫的發(fā)生多與炎癥因子異常表達(dá)有關(guān),但應(yīng)用其拮抗劑后其肺水腫程度無明顯減輕。氧化應(yīng)激反應(yīng)也被認(rèn)為與肺水腫有關(guān),但應(yīng)用抗氧化劑治療和預(yù)防,療效也不顯著。 水通道蛋白(Aquaporin, AQP)是新近發(fā)現(xiàn)與水通透性有關(guān)的細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,目前認(rèn)為與肺組織密切的有AQP1、AQP3、AQP4、AQP5。胎兒肺組織AQP1表達(dá)呈緩慢上升,而臨近預(yù)產(chǎn)期時顯著增加,生后初期隨日齡呈時向性變化,提示生后初期AQP1與肺內(nèi)液體快速轉(zhuǎn)運(yùn)密切相關(guān)。 鈉通道蛋白(Epithelium sodium channel, ENaC)是一種跨膜蛋白,是肺內(nèi)液體轉(zhuǎn)運(yùn)的重要通道,由αβγ三個同源亞基組成,早產(chǎn)兒氣道上皮ENaC表達(dá)明顯低于足月兒,其低水平的表達(dá)與呼吸窘迫發(fā)生密切相關(guān) 本研究采用高氧致肺損傷新生鼠模型為對象,通過測定肺組織AQP1、a-ENaC的表達(dá)基因及蛋白表達(dá),試圖闡明AQP1、a-ENaC在高氧肺損傷發(fā)生、發(fā)展中的動態(tài)表達(dá)規(guī)律。 材料與方法 一、動物實(shí)驗 (一)實(shí)驗分組及動物模型的制備 1、研究對象 健康Wistar大鼠雌雄各40只,雌雄交配(4：1),孕22-23d自然分娩的新生鼠80只,生后12小時內(nèi)(0d),依據(jù)吸氧濃度Fi02隨機(jī)分組。 2、動物模型建立：采用以往所建立的研究方法 將新生Wistar大鼠80只依據(jù)吸氧濃度分為隨機(jī)二組：實(shí)驗組(Fi020.90)和對照組(Fi020.21),每組均為40只； 實(shí)驗組：生后即置于氧箱中,持續(xù)輸入氧氣,維持Fi02為0.90(用測氧儀監(jiān)測),C02濃度0.5%(用鈉時會吸收C02),溫度25～27℃,濕度50%70%。每天定時開箱0.5小時,添水、飼料及更換墊料,并與空氣對照組交換母鼠以避免因氧中毒而致喂養(yǎng)能力下降。 對照組：Fi02為0.21,放置與模型組同一室內(nèi)空氣飼養(yǎng),具體方法及實(shí)驗控制因素同實(shí)驗組。 (二)實(shí)驗標(biāo)本的收集、方法 于實(shí)驗后24h、48h、72h 5、7天分別從兩組隨機(jī)抽取8只,用10%水合氯醛麻醉后立即打開胸腔,分離肺組織。將左肺置于4%的多聚甲醛中固定,石蠟包埋,常規(guī)制備5um切片,蘇木素-伊紅染色后用于肺形態(tài)學(xué)觀察。右肺組織置于無Rnase的Eppendorf管中,-80℃保存,用于免疫組化、免疫熒光、RT-PCR檢測。 二、實(shí)驗方法及檢測指標(biāo) (一)肺組織形態(tài)學(xué)觀察 光鏡下觀察肺組織形態(tài)改變,觀察高氧致新生鼠CLD肺的病理學(xué)改變。 (二)免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測肺組織AQP1蛋白表達(dá),免疫熒光檢測肺組織α-ENaC蛋白表達(dá) 于每個時間點(diǎn)抽取染色清晰的切片10張,每張切片于光鏡下(×400)隨機(jī)抽取5個視野,固定窗口面積,以胞漿中只有棕黃色顆粒為陽性細(xì)胞,其蛋白定量利用美國的Universai Imagining Porppration圖像分析系統(tǒng),應(yīng)用Meta Morph軟件測定平均積分光密度值,用來表示肺組織AQP1蛋白表達(dá)強(qiáng)度。 每個時間點(diǎn)抽取染色清晰的切片10張,每張切片于光鏡下(×400)隨機(jī)抽取5個視野,固定窗口,于暗室中發(fā)翠綠色熒光為陽性表達(dá),依據(jù)表達(dá)強(qiáng)弱來表示α-ENaC蛋白表達(dá)的強(qiáng)度。 (三)Real-time PCR檢測肺組織AQP1、α-ENaC mRNA的表達(dá) 先構(gòu)建目的基因(AQP1基因和a-ENaC基因)和管家基因(GAPDH)的RNA標(biāo)準(zhǔn)品,制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,利用標(biāo)準(zhǔn)曲線對樣品中的目的基因和管家基因分別進(jìn)行定量。通過管家基因的校正,檢測各組細(xì)胞中AQP1及a-ENaC目的基因的相對表達(dá)量。AQP1 mRNA的相對表達(dá)量=AQP1基因拷貝數(shù)／GAPDH基因拷貝數(shù)。α-ENaC mRNA的相對表達(dá)量=a-ENaC基因拷貝數(shù)／GAPDH基因拷貝數(shù),校正結(jié)果以生理鹽水對照組為1,其余組與之相比較。 三統(tǒng)計學(xué)分析 所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,應(yīng)用SPSS14.0對各組間數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,兩樣本方差齊性檢驗采用F檢驗,根據(jù)樣本的方差齊性檢驗F值,兩組間比較用t檢驗或t'檢驗,多組間比較采用ANOVA分析,以P0.05表示統(tǒng)計學(xué)有顯著意義。 結(jié)果 一、肺組織形態(tài)學(xué)改變 對照組大鼠1-3天肺組織水腫,肺泡腔內(nèi)大量滲液,間質(zhì)水腫,小血管擴(kuò)張充血,5-7天支氣管、肺泡結(jié)構(gòu)趨于正常,肺結(jié)構(gòu)完整,肺泡間隔均勻一致,壁光滑,無滲出液,無出血及灶性肺水腫；高氧1-2天與對照組無明顯差別；高氧暴露3天與對照組比較,見肺泡上皮細(xì)胞腫脹,肺泡腔內(nèi)大量滲液,小血管擴(kuò)張充血,間質(zhì)水腫,炎性細(xì)胞明顯增多,但肺泡結(jié)構(gòu)尚完整；高氧5、7天時上述改變進(jìn)一步加重,肺泡壁增厚,肺組織結(jié)構(gòu)紊亂。 二、肺組織免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測肺組織AQP1蛋白表達(dá) 實(shí)驗開始后,第24h、48h實(shí)驗組與對照組肺組織AQP1蛋白表達(dá)強(qiáng)度無明顯差異(P0.05)。第3天AQP1蛋白表達(dá)明顯低于對照組(P0.05),高氧第5、7天實(shí)驗組AQP1蛋白表達(dá)減弱更明顯。(P0.01) 三、肺組織免疫熒光檢測α-ENaC蛋白表達(dá) 實(shí)驗后,第24H、48ha-ENaC蛋白表達(dá)強(qiáng)度無明顯差異,第3、5、7天實(shí)驗組有明顯減弱。 四、RT-PCR技術(shù)檢測肺組織AQP1mRNA、α-ENaCmRNA表達(dá) 實(shí)驗開始后24h、48h天,實(shí)驗組和對照組肺組織AQP1mRNA、α-ENaCmRNA基因表達(dá)強(qiáng)度無顯著差異(P0.05)；AQP1基因表達(dá)與對照組相比于高氧后第3、5、7天減弱更加明顯(P0.05)。a-ENaC基因表達(dá)與對照組相比,第3天下降,第5、7天表達(dá)明顯減弱(P0.05)。 結(jié)論 1、高氧暴露后第3天AQP1蛋白及基因表達(dá)下降,第3、5、7天下降更明顯,該基因蛋白表達(dá)變化與高氧3-7天出現(xiàn)肺水腫呈現(xiàn)同一時相變化。推測此時AQP1的表達(dá)下降,可能與肺水腫有關(guān)。 2、高氧暴露后α-ENaCmRNA表達(dá)逐漸下降,第5、7天下降明顯,也可能與肺水腫的出現(xiàn)有關(guān)。
【圖文】：

新生大鼠肺組織HE染色(X200)A對照組1天肺組織，B實(shí)驗組1天與肺組織無明顯差異，C對照組3天肺組織表現(xiàn)，，D實(shí)驗組3天肺組織表現(xiàn)，E對照組7天肺組織表現(xiàn)，F(xiàn)實(shí)驗組7天肺組織表現(xiàn)為充血水腫，滲出明顯.

新生大鼠組織AQPI免疫組化(X400)A對照組ldAQPI有表達(dá)，B實(shí)驗組ld與對照組無明顯差異。C對照組3dAQPI表達(dá)明顯，D實(shí)驗組3d較對照組表達(dá)減少。E對照組7dAQPI表達(dá)明顯，F(xiàn)實(shí)驗組7d較對照組表達(dá)減少。
【學(xué)位授予單位】：中國醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R722.1

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2690782