【摘要】：第一部分RSV感染對(duì)糖皮質(zhì)激素受體(GR)的影響目的:RSV是引起全球5歲以下嬰幼兒下呼吸道感染最常見的病毒病原體。目前尚無有效疫苗預(yù)防與藥物防治。RSV感染誘發(fā)的炎癥對(duì)糖皮質(zhì)激素治療不敏感,機(jī)制尚不完全清楚。糖皮質(zhì)激素發(fā)揮其抗炎效果通過調(diào)控糖皮質(zhì)激素受體(glucocorticoid receptors,GR)的表達(dá)轉(zhuǎn)運(yùn)。GR表達(dá)降低是糖皮質(zhì)激素治療不敏感的重要機(jī)制,RSV感染是否下調(diào)GR的表達(dá)導(dǎo)致糖皮質(zhì)激素治療不敏感尚不清楚。故此,本部分主要研究RSV感染對(duì)GR表達(dá)的影響。方法:收集RSV感染患兒住院第一天的NPAs標(biāo)本及正常對(duì)照組NPAs標(biāo)本,檢測(cè)GR mRNA和蛋白表達(dá)水平;運(yùn)用RSV和UV-RSV感染A549細(xì)胞及BEAS-2B細(xì)胞模型,檢測(cè)GR mRNA和蛋白表達(dá)水平。結(jié)果:1.RSV感染患兒NPA中GR mRNA和蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組均顯著降低(P0.01);2.RSV感染A549細(xì)胞及BEAS-2B細(xì)胞后,GR mRNA和蛋白表達(dá)水平呈一個(gè)感染時(shí)間依賴性降低(P0.05);3.UV-RSV對(duì)GR mRNA和蛋白表達(dá)水平無影響。結(jié)論:RSV活病毒感染可降低GR mRNA和蛋白表達(dá)水平。第二部分RSV感染后miR-29a的表達(dá)及其對(duì)GR mRNA表達(dá)水平的影響目的:miRNA是一類22nt大小的非編碼RNA,可以調(diào)控基因的3’UTR,降低其mRNA的穩(wěn)定性,介導(dǎo)mRNA降解。GR 3’UTR有多個(gè)miRNA結(jié)合位點(diǎn),其表達(dá)可受miRNA的調(diào)控。軟件預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)GR3’UTR 1078-1084位點(diǎn)為miR-29a的靶標(biāo)序列。miR-29a是一個(gè)上皮細(xì)胞源性的miRNA,文獻(xiàn)報(bào)道RSV感染可升高miR-29a表達(dá),也可降低GR mRNA水平,故我們推測(cè)RSV通過調(diào)控miR-29a表達(dá)降低GR mRNA表達(dá)水平。方法:檢測(cè)RSV感染患兒和正常對(duì)照組NPAs中miR-29a的表達(dá)并分析其與GR mRNA和蛋白表達(dá)水平的相關(guān)性;建立RSV和UV-RSV感染A549細(xì)胞和BEAS-2B細(xì)胞感染模型,檢測(cè)miR-29a的表達(dá);敲減或過表達(dá)miR-29a后,檢測(cè)RSV感染A549細(xì)胞和BEAS-2B細(xì)胞中GR mRNA和蛋白表達(dá)水平;進(jìn)一步通過雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)驗(yàn)證GR是否為miR-29a的靶基因。結(jié)果:1.RSV感染患兒NPAs中miR-29a表達(dá)增高,且與GR mRNA及蛋白表達(dá)有顯著相關(guān)性(P0.01);2.RSV感染A549細(xì)胞和BEAS-2B細(xì)胞后,miR-29a呈一個(gè)感染時(shí)間與感染劑量依賴性增高(P0.05);3.敲減或過表達(dá)miR-29a的表達(dá)顯著恢復(fù)RSV感染對(duì)GR mRNA及蛋白的降低(P0.05)。4.GR是miR-29a的一個(gè)靶基因。結(jié)論:RSV感染后上調(diào)miR-29a的表達(dá),降低GR mRNA和蛋白表達(dá)水平。第三部分RSV感染后p53的表達(dá)及其對(duì)GR蛋白表達(dá)水平的影響目的:抑制miR-29a的表達(dá)只可部分恢復(fù)RSV感染對(duì)GR蛋白的降低,且使用MG-132蛋白酶抑制劑后可恢復(fù)GR蛋白表達(dá),表明RSV對(duì)GR蛋白的抑制作用還存在其他機(jī)制。在細(xì)胞處于低氧狀態(tài)時(shí),GR蛋白降解主要通過與p53及Mdm2蛋白相互作用,啟動(dòng)Mdm2介導(dǎo)的泛素化途徑降解。RSV感染可誘導(dǎo)宿主細(xì)胞呈一個(gè)低氧狀態(tài),故此我們推測(cè)RSV通過調(diào)控p53-Mdm2下調(diào)GR的蛋白表達(dá)。方法:檢測(cè)RSV感染患兒和正常對(duì)照組NPAs中p53蛋白的表達(dá)并分析其與GR蛋白表達(dá)水平的相關(guān)性;建立RSV和UV-RSV感染A549細(xì)胞感染模型,檢測(cè)p53蛋白表達(dá)水平及GR、p53和Mdm2三者之間的相互作用;抑制Mdm2的表達(dá)水平、磷酸化水平及與p53的相互作用,檢測(cè)RSV感染的A549細(xì)胞中GR蛋白表達(dá)水平及GR、p53和Mdm2三者之間的相互作用。結(jié)果:1.RSV感染患兒NPAs中p53蛋白表達(dá)降低,且與GR蛋白表達(dá)有顯著相關(guān)性(P0.01);2.RSV感染A549細(xì)胞后,p53呈一個(gè)感染時(shí)間與感染劑量依賴性降低(P0.01);3.抑制Mdm2的表達(dá)水平、磷酸化水平及與p53的相互作用可部分恢復(fù)GR蛋白表達(dá)水平(P0.05)。結(jié)論:RSV感染后通過調(diào)控p53-Mdm2介導(dǎo)GR蛋白表達(dá)水平的下降。第四部分RSV NS1蛋白在調(diào)控GR表達(dá)的作用機(jī)制研究目的:NS1基因位于RSV基因組3’端,是早期表達(dá)最多的基因和蛋白,介導(dǎo)著多種與宿主細(xì)胞相互作用的生物學(xué)功能。RSV NS1蛋白可上調(diào)miR-29a介導(dǎo)IFNR1的降低,還可激活PI3K-Akt信號(hào)通路。PI3K-Akt信號(hào)通路激活后可磷酸化Mdm2降解p53。NS1蛋白是否是RSV感染降低GR表達(dá)的最重要蛋白及NS1是否通過調(diào)控miR-29a及p53-Mdm2介導(dǎo)GR的降低尚不清楚。故本部分的研究目的為:1.證實(shí)NS1是否可降低GR表達(dá);2.進(jìn)一步證實(shí)NS1是否是通過調(diào)控miR-29a及p53-Mdm2降低GR表達(dá)。方法:建立RSV感染A549細(xì)胞感染模型,測(cè)定不同時(shí)間點(diǎn)RSV編碼的10個(gè)基因的表達(dá)水平;si RNA敲低NS1基因表達(dá)后,檢測(cè)GR mRNA、GR蛋白、miR-29a及p53蛋白表達(dá)水平;進(jìn)一步在NS1基因敲低后:過表達(dá)miR-29a,檢測(cè)GR mRNA、GR蛋白及其轉(zhuǎn)錄調(diào)控的FKBP51、GILZ mRNA表達(dá)水平;過表達(dá)Mdm2后,檢測(cè)p53蛋白、GR蛋白及其轉(zhuǎn)錄調(diào)控的FKBP51、GILZ mRNA表達(dá)水平;進(jìn)一步檢測(cè)RSV感染患兒中NS1基因表達(dá)并分析其與GR mRNA、GR蛋白、miR-29a、p53蛋白表達(dá)水平的相關(guān)性。結(jié)果:1.在早期RSV感染A549細(xì)胞模型中,RSV編碼的10個(gè)基因中,NS1基因是表達(dá)最多的;2.NS1基因敲低后可恢復(fù)GR mRNA、GR蛋白、miR-29a、p53蛋白的表達(dá)水平(P0.05);3.NS1基因敲低后:過表達(dá)miR-29a可降低GR mRNA、GR蛋白及FKBP51、GILZ mRNA表達(dá)水平(P0.05);過表達(dá)Mdm2后,p53蛋白、GR蛋白及FKBP51、GILZ mRNA表達(dá)水平降低(P0.05)。結(jié)論:RSV NS1通過上調(diào)miR-29a及調(diào)控p53-Mdm2介導(dǎo)GR mRNA和蛋白的降解。
【圖文】：

是一類大小為 22nt 的非編碼 RNA，具有多種重要的調(diào)節(jié)功能。每個(gè) miRNA 可以有多個(gè)靶基因，而同一個(gè)基因也可由幾個(gè) miRNA 共同調(diào)節(jié)。miRNA 發(fā)揮功能要有三種方式：（1）主要與靶基因 3·UTR 靶序列互補(bǔ)結(jié)合，作用方式與功能與siRNA 非常類似，調(diào)控基因 mRNA 的穩(wěn)定性，降解 mRNA；（2）抑制靶基因的翻譯功能，與靶基因不完全互補(bǔ)結(jié)合，進(jìn)而抑制其翻譯而不影響 mRNA 的穩(wěn)定性；（3）同時(shí)具有以上兩種作用模式，當(dāng)與靶基因 3·UTR 靶序列互補(bǔ)結(jié)合時(shí)，降解 mRNA；當(dāng)與靶基因不完全結(jié)合時(shí)，調(diào)節(jié)其翻譯功能。miRNA 對(duì) GR 表達(dá)的調(diào)控包括以上三個(gè)方面，主要調(diào)控由 miR-124a，miR-142a，，miR18a，miR-130a、miR-29a 等完成[32-43]。前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示 RSV 感染后可誘導(dǎo)多個(gè) miRNA 的升高，其中包括 miR-29a、miR-124a，miR-142a。而 miR-124a，miR-142a，miR-29a對(duì) GR 表達(dá)的調(diào)控主要通過調(diào)控 GR 3·UTR 降解 mRNA。故此，我們推測(cè) RSV 感染后可能通過上調(diào) miRNA 表達(dá)，降解 GR mRNA。

重慶醫(yī)科大學(xué)博士研究生學(xué)位論文2.3 RSV 感染患兒 NPA 中 GR mRNA（NR3C1）表達(dá)水平降低在糖皮質(zhì)激素治療不敏感的機(jī)制中，其中一個(gè)很重要的機(jī)制是 GRβ 表達(dá)升高、GRα 表達(dá)降低導(dǎo)致 GRα/GRβ 表達(dá)水平失調(diào)。既往研究，在 RSV 感染的嬰幼兒中，外周血單個(gè)核細(xì)胞中GRβ的mRNA水平表達(dá)是增高的。呼吸道上皮細(xì)胞是RSV 感染的靶細(xì)胞，GRα 和 GRβ 在上皮細(xì)胞中表達(dá)含量均較高。迄今尚無在呼吸道上皮細(xì)胞中 RSV 感染對(duì) GRα 與 GRβ 表達(dá)水平影響的研究報(bào)道。故此我們首先檢測(cè)在 RSV 感染患兒 NPA 中 GRα 與 GRβ mRNA 表達(dá)水平。如圖所示，RSV 感染可降低 GRα 與 GRβ mRNA 水平，且 GRβ mRNA 降低水平較對(duì)照組更為明顯。
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R725.6

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本文編號(hào)：2690415