【摘要】：目的:ARHGAP18基因調(diào)節(jié)細(xì)胞形態(tài)、遷移和粘附,參與細(xì)胞增殖凋亡等過程,影響疾病發(fā)生發(fā)展。探討ARHGAP18基因在胎兒血紅蛋白(fetal hemoglobin,HbF)合成中的作用,為β地中海貧血的靶向治療提供理論依據(jù)。方法:1.體外適宜條件下培養(yǎng)人類慢性髓系白血病細(xì)胞系K562細(xì)胞,實(shí)時(shí)熒光定量PCR聚合酶鏈反應(yīng)(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-PCR)驗(yàn)證ARHGAP18基因在K562細(xì)胞表達(dá)豐度,以A549細(xì)胞作為對(duì)照。2.特異性siRNA設(shè)計(jì),構(gòu)建慢病毒載體并篩選敲減率最佳的慢病毒載體:根據(jù)Genebank中ARHGAP18基因mRNA序列,設(shè)計(jì)合成3條針對(duì)ARHGAP18基因編碼區(qū)的siRNA靶序列,隨機(jī)設(shè)計(jì)無關(guān)對(duì)照序列作為陰性對(duì)照。構(gòu)建3種帶有綠色熒光蛋白篩選標(biāo)記的ARHGAP18基因特異性shRNA重組慢病毒:shARHGAP18-KD1、shARHGAP18-KD2、sh ARHGAP18-KD3及陰性對(duì)照重組病毒shCtrl。將3種攜帶sh ARHGAP18病毒和shCtr1病毒分別轉(zhuǎn)染K562細(xì)胞株,熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率。RT-PCR分別檢測(cè)ARHGAP18基因轉(zhuǎn)錄水平,篩選靶點(diǎn)敲減效率最佳的一種重組慢病毒。最佳干擾序列和陰性對(duì)照序列進(jìn)入后續(xù)實(shí)驗(yàn)。3.設(shè)置重組慢病毒shARHGAP18-KD組、陰性對(duì)照shCtrl組和空白對(duì)照CON組,轉(zhuǎn)染K562細(xì)胞。分別通過CCK-8試劑盒(Cell Counting Kit-8,CCK-8)和流式細(xì)胞儀(flow cytometry,FCM)檢測(cè)敲減ARHGAP18基因后不同時(shí)間點(diǎn)K562細(xì)胞增殖和凋亡情況。探討體外特異性沉默ARHGAP18基因?qū)562細(xì)胞的生物學(xué)特性的影響。4.RT-PCR驗(yàn)證敲減ARHGAP18基因后γ珠蛋白基因HBG1和HBG2mRNA表達(dá)變化,探討ARHGAP18基因在HbF合成中的作用。HBG1/2基因編碼γ珠蛋白鏈,兩條γ珠蛋白鏈與兩條α珠蛋白鏈構(gòu)成HbF。結(jié)果:1.K562細(xì)胞中ARHGAP18 mRNA表達(dá)水平是對(duì)照的7.41倍(P0.01)。2.熒光顯微鏡下重組慢病毒感染K562細(xì)胞感染效率80%。RT-PCR顯示K562細(xì)胞中,shARHGAP18-KD1組較shCtrl組ARHGAP18基因敲減率7.2%(P0.05);相比于shCtrl組,shARHGAP18-KD2組基因敲減率69.0%(P0.05);shARHGAP18-KD3組基因敲減率65.4%(P0.05)。sh ARHGAP18-KD2組是最佳干擾序列組。3.CCK-8試驗(yàn)結(jié)果是空白組、陰性對(duì)照組和shARHGAP18-KD2組K562細(xì)胞在感染后5天細(xì)胞增殖無明顯差異。FCM結(jié)果顯示三組細(xì)胞凋亡率存在差異,(shCtrl組:4.80±0.25%,CON組:2.91±0.18%,shARHGAP18-KD2組:3.74±0.12%,CON對(duì)比shCtrl P=4.60×10~(-4),shCtrl對(duì)比sh ARHGAP18-KD2 P=2.80×10~(-3),CON對(duì)比sh ARHGAP18-KD2 P=2.80×10~(-3)),但凋亡率差異小于20%。4.RT-PCR的結(jié)果顯示,與shCtrl組相比,轉(zhuǎn)染shARHGAP18-KD2的細(xì)胞中HBG1基因表達(dá)增加了2.2倍(P=3.91×10~(-2)),HBG2基因表達(dá)增加了1.6倍(P=1.60×10~(-3))。結(jié)論:1.ARHGAP18基因在K562細(xì)胞中高表達(dá)。2.shARHGAP18-KD2在K562細(xì)胞中具有良好的靶向效率。建立了ARHGAP18基因相對(duì)低表達(dá)的K562細(xì)胞株。在K562細(xì)胞中敲減ARHGAP18基因,促進(jìn)細(xì)胞凋亡,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,但對(duì)細(xì)胞增殖影響不顯著。3.ARHGAP18基因與HbF相關(guān),敲減ARHGAP18基因,HBG1、HBG2表達(dá)增多,ARHGAP18基因有望成為β地中海貧血的治療靶標(biāo)。
【圖文】：

最佳干擾序列（shARHGAP18-KD2）和陰性對(duì)照序列（shCtrl）進(jìn)入后續(xù)實(shí)驗(yàn)。表3-1 RT-PCR檢測(cè)ARHGAP18 mRNA的表達(dá)（平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差）分組 ARHGAP18 mRNA表達(dá)量 敲減效率（%）NC 1.00±0.00 0.00KD1 0.93±0.11 7.20KD2 0.31±0.06 69.00KD3 0.35±0.08 65.40圖 3-2：慢病毒載體轉(zhuǎn)染 K562 細(xì)胞敲減 ARHGAP18（A）慢病毒感染細(xì)胞的效率，，放大倍率 x200（B）ARHGAP18 mRNA 表達(dá)

AP18-KD2組（KD組）、空白對(duì)照組（CON組）和陰性對(duì)照組（標(biāo)儀對(duì)波長(zhǎng)450nm的光的吸收率隨時(shí)間變化的對(duì)比，OD450反的細(xì)胞的數(shù)量。CON組對(duì)比NC組P=7.96×10-8, NC組對(duì)比K0-7, CON組對(duì)比KD組P=1.38×10-9。每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)代表吸光度值準(zhǔn)差（表格3-1，圖3-3）。表格3-2 3組細(xì)胞1~5天CCK8 OD450值（平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差）Day 1 Day 2 Day 3 Day 4 Day 50.24±0.00 0.46±0.01 0.854±0.02 1.643±0.07 3.26±00.28±0.01 0.57±0.03 1.065±0.04 1.838±0.06 3.31±00.30±0.01 0.63±0.01 1.048±0.05 1.709±0.04 3.00±08檢測(cè)結(jié)果表明：相比NC組，KD組細(xì)胞增殖無明顯變化。18基因?qū)562細(xì)胞增殖影響不明顯。
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R725.5

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8 靳q

本文編號(hào)：2690266