【摘要】： 第一部分治療劑量范圍內(nèi)強(qiáng)的松與ACTH大鼠用藥模型建立 目的:建立在臨床治療劑量范圍內(nèi)強(qiáng)的松與ACTH的嬰幼大鼠實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?方法:將強(qiáng)的松或ACTH對(duì)HPA軸的影響程度作為劑量探索的原則。①?gòu)?qiáng)的松劑量的確認(rèn):采集10例臨床使用5天以上治療劑量強(qiáng)的松患兒清晨血清標(biāo)本,獲得用藥后平均皮質(zhì)醇血濃度。再以體表面積公式換算,將24只7日齡雄性SD嬰幼鼠分為:2mg/kg/d、3mg/kg/d和4mg/kg/d給藥組,以及正常對(duì)照組(n=6)共4組。每日清晨8點(diǎn)一次性灌胃給藥,連續(xù)7日,第8日清晨8點(diǎn)麻醉后取血,測(cè)血清皮質(zhì)酮濃度。②ACTH劑量的確認(rèn):60只14日齡雄性嬰幼鼠,根據(jù)給藥劑量和時(shí)間分為9個(gè)實(shí)驗(yàn)組和1個(gè)對(duì)照組(n=6)。實(shí)驗(yàn)組麻醉后在三個(gè)時(shí)間點(diǎn)(2 pm,3 pm,3: 30pm),以大小相差40倍的3個(gè)劑量(3.8U/m~2,38 U /m~2,150 U /m~2)分別腹腔注射ACTH一次;對(duì)照組僅麻醉不給予其他干預(yù)。4pm取血測(cè)皮質(zhì)酮濃度。 結(jié)果:①?gòu)?qiáng)的松劑量的確認(rèn):10名患兒血清平均皮質(zhì)醇濃度為87.18±39.71 nmol/L,其均值為正常兒童均值(552nmol/L)的15.79%。②當(dāng)強(qiáng)的松劑量為4mg/kg/d時(shí),大鼠皮質(zhì)酮濃度降低至對(duì)照組的15.17%,與臨床患兒皮質(zhì)醇抑制程度相一致。③在腹腔注射大小相差40倍的不同劑量ACTH后30分鐘時(shí),嬰幼鼠皮質(zhì)酮水平均升高達(dá)到同一峰值,60分鐘時(shí)開(kāi)始下降,120分鐘時(shí)各劑量組皮質(zhì)酮水平均回落至基礎(chǔ)值,與對(duì)照組無(wú)顯著差異。 結(jié)論:①4mg/kg/d連續(xù)7日給藥后,嬰幼鼠血清皮質(zhì)酮濃度被抑制為正常的15%左右,與臨床測(cè)試相一致,因而被確認(rèn)為本研究強(qiáng)的松實(shí)驗(yàn)劑量。②與人類(lèi)研究相一致,注射ACTH30分鐘后,大鼠體內(nèi)皮質(zhì)酮增高程度不隨ACTH劑量變化而顯示差異。因而將臨床嬰兒痙攣治療劑量按照體表面積直接換算,構(gòu)建與臨床治療劑量匹配的ACTH實(shí)驗(yàn)大鼠模型。 第二部分強(qiáng)的松與ACTH致嬰幼期腦損傷的組織學(xué)研究 目的:以健康大鼠為對(duì)照,觀察不同療程和劑量的強(qiáng)的松與ACTH對(duì)生后早期嬰幼鼠腦發(fā)育的組織病理學(xué)影響。 方法: 7日齡嬰幼期和2月齡成年健康SD雄性大鼠各192只,分別給予:(1)強(qiáng)的松組:兩年齡組各96只,分為治療劑量組(4mg/kg/d)、小劑量組(2mg/kg/d)和對(duì)照組(賦形劑0.5%CMC),清晨一次灌胃給藥;(2)ACTH組:同樣分為治療劑量組(150U/m~2/d)、小劑量組(38U/ m~2/d)和對(duì)照組(生理鹽水),每日劑量分兩次腹腔注射給藥。 每一劑量組(n=32)又分為長(zhǎng)療程組(3周)(n=16)和短療程組(10天)(n=16)。分別在完成預(yù)定療程后次日清晨(n=8)和停藥4周后(n=8)留取標(biāo)本,記錄體重、腦重,測(cè)血清皮質(zhì)酮濃度,對(duì)額葉皮層及海馬切片行HE及尼氏染色,透射電鏡觀察海馬超微結(jié)構(gòu)。 結(jié)果:①嬰幼鼠短程治療劑量強(qiáng)的松組血清皮質(zhì)酮抑制程度為對(duì)照組的10.75%,短程治療劑量ACTH組血清皮質(zhì)酮升高程度為對(duì)照組的1.83倍,與第一部分的劑量預(yù)測(cè)基本一致,表明模型建立成功。②短程強(qiáng)的松或ACTH均導(dǎo)致嬰幼鼠及成年鼠體重顯著降低,與對(duì)照相比降低幅度在7.9～17.5%間,劑量愈大降低愈明顯。停藥4周后,兩年齡組的體重有不同程度恢復(fù),但仍低于對(duì)照。長(zhǎng)程給藥對(duì)體重的抑制更為明顯,對(duì)嬰幼鼠體重的抑制程度達(dá)20.6～37.7%。停藥4周后,兩年齡鼠體重均值仍較對(duì)照低9.8～23.5%。③嬰幼鼠用藥后發(fā)生明顯腦重下降。短程用藥后兩藥致嬰幼鼠腦重降低的幅度在5.3～10.7%間,降低幅度與劑量相關(guān)。停藥4周后強(qiáng)的松組已基本恢復(fù)正常,唯ACTH組腦重仍較對(duì)照組減低近20%。長(zhǎng)程用藥后嬰幼鼠強(qiáng)的松組抑制幅度與短程相似,ACTH組抑制幅度高達(dá)11.7～15.9%。長(zhǎng)程給藥對(duì)成年鼠腦重也有輕度影響,抑制幅度2.2%～4.8%間。停藥4周后,成年鼠腦重與對(duì)照不再有差距,但嬰幼鼠兩藥治療劑量組腦重仍較對(duì)照分別減低4.1%和13.2%(P0.01)。④HE染色發(fā)現(xiàn),兩藥短程治療劑量與長(zhǎng)程兩劑量的嬰幼鼠,以及長(zhǎng)程治療劑量成年鼠均可見(jiàn)明顯的神經(jīng)細(xì)胞變性及壞死,停藥4周后均未再見(jiàn)明顯組織學(xué)病變。⑤尼氏染色發(fā)現(xiàn),嬰幼鼠在兩藥物的短程和長(zhǎng)程治療劑量,以及長(zhǎng)程小劑量給藥時(shí),均可見(jiàn)額葉皮層及海馬神經(jīng)細(xì)胞尼氏體減少、溶解消失現(xiàn)象,額葉皮層神經(jīng)細(xì)胞計(jì)數(shù)較對(duì)照組明顯減少,分別達(dá)25.9%～32.1%(強(qiáng)的松)和24.4%～29.1%(ACTH)間。停藥4周后,神經(jīng)細(xì)胞病變不再明顯,但無(wú)論短程或長(zhǎng)程用藥,治療劑量ACTH嬰幼鼠神經(jīng)細(xì)胞計(jì)數(shù)仍低于同齡對(duì)照15.8%～20.3%。無(wú)論短程或長(zhǎng)程用藥,兩藥均未引起成年鼠額葉皮層神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)及數(shù)量的明顯異常,但在長(zhǎng)程治療劑量時(shí)可見(jiàn)海馬神經(jīng)細(xì)胞有尼氏體減少、溶解消失現(xiàn)象,停藥4周后,病變不再明顯。⑥透射電鏡發(fā)現(xiàn)病變海馬神經(jīng)細(xì)胞染色質(zhì)邊集,濃縮成塊狀,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張,線(xiàn)粒體腫脹,血管周?chē)[。并見(jiàn)髓鞘溶解變性及分層現(xiàn)象。停藥4周后超微結(jié)構(gòu)基本恢復(fù)正常。 結(jié)論:①?gòu)?qiáng)的松與ACTH均會(huì)引起嬰幼鼠和成年鼠體重明顯降低。②強(qiáng)的松與ACTH對(duì)嬰幼鼠和成年鼠腦組織均有損傷作用,但嬰幼鼠更敏感。停藥4周后,額葉皮層神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量仍然減少,表明激素,尤其ACTH對(duì)嬰幼鼠腦組織可能造成持久性損傷。③強(qiáng)的松與ACTH對(duì)細(xì)胞數(shù)量的減少與腦重的降低并不平行,提示腦重的降低不僅由細(xì)胞數(shù)量減少引起,還可能涉及其他機(jī)制的作用。 第三部分強(qiáng)的松與ACTH致嬰幼期腦損傷機(jī)理的初步探討 目的:初步探討強(qiáng)的松與ACTH導(dǎo)致腦損傷的機(jī)理。 方法:實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組同第二部分。ELISA檢測(cè)血清NSE,免疫組化檢測(cè)額葉和海馬皮層Bcl-2、Bax蛋白表達(dá),TUNEL檢測(cè)凋亡神經(jīng)細(xì)胞。 結(jié)果:①?gòu)?qiáng)的松或ACTH在治療劑量下短程或長(zhǎng)程給予均可致嬰幼鼠血清NSE顯著增高,短程組分別增高50.62%與57.34%(P㩳0.05或P㩳0.01),長(zhǎng)程組分別增高103.23%與100.04%(P㩳0.01);成年鼠僅在兩藥治療劑量下長(zhǎng)程給藥時(shí)方顯著增高,分別為66.81%和60.40%(P㩳0.05)。停藥4周后,各組NSE較對(duì)照組已無(wú)顯著差異。②短程或長(zhǎng)程給予兩藥的嬰幼或成年各組額葉及海馬皮層Bcl-2蛋白表達(dá)與對(duì)照組相比均無(wú)顯著差異。③短程給藥時(shí)Bax蛋白表達(dá)僅在兩藥治療劑量嬰幼組有顯著增高(P㩳0.01),Bax/Bcl-2比值亦升高為對(duì)照組的1.91～2.29倍,而成年鼠則無(wú)顯著增高。兩藥長(zhǎng)程治療劑量和小劑量均致嬰幼組Bax蛋白在額葉和海馬皮層表達(dá)顯著增高,Bax/Bcl-2比值達(dá)對(duì)照組的1.92～2.70倍,而成年鼠僅治療劑量下在海馬皮層有增高。停藥4周后各組Bax以及Bax/Bcl-2比值均恢復(fù)至對(duì)照組水平。④兩藥短程治療劑量、長(zhǎng)程兩劑量嬰幼組的額葉及海馬皮層,長(zhǎng)程治療劑量成年組的海馬皮層,均較對(duì)照組TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)明顯增多,停藥4周后均消失。 結(jié)論:①除過(guò)度凋亡外,以海馬為主的神經(jīng)細(xì)胞壞死也是強(qiáng)的松與ACTH導(dǎo)致嬰幼腦損傷的主要機(jī)制。②Bax蛋白表達(dá)和Bax/Bcl-2比值的明顯增高可能是本研究中激素腦損傷中凋亡的重要啟動(dòng)因素。③ACTH和糖皮質(zhì)激素最易引起嬰幼期大腦損傷,療程越長(zhǎng)越嚴(yán)重。長(zhǎng)程用藥還可引起成年鼠腦損傷。④停藥4周后腦內(nèi)凋亡及壞死過(guò)程均消失。
【圖文】：

圖 2-1 長(zhǎng)程生理鹽水腹腔注射對(duì)照組嬰幼鼠額葉皮層神經(jīng)細(xì)胞(×400,HE 染色)Figure2-1 the normal cells in the frontal cortex ofbaby rat treated with saline by intraperitonealinjection for long term (×400，HE staining)圖 2-2 長(zhǎng)程灌胃對(duì)照組嬰幼鼠額葉皮層神經(jīng)細(xì)胞(×400,尼氏染色)Figure2-2 the normal cells in the frontal cortex ofbaby rat orally administrated with CMC for longterm(×400,nissl staining)圖 2-3 長(zhǎng)程小劑量 ACTH 給藥嬰幼鼠額葉皮層神經(jīng)細(xì)胞變性(×400,HE 染色)Figure2-3 neurodegeneration in the frontal cortex ofbaby rat treated with low-dose ACTH for long term(×400, HE staining)圖 2-4 長(zhǎng)程小劑量強(qiáng)的松給藥嬰幼鼠額葉皮層神經(jīng)細(xì)胞變性(×400,尼氏染色)Figure2-4 neurodegeneration in the frontal cortex ofbaby rat treated with low-dose prednisone for longterm(×400,nissl staining)

圖 2-1 長(zhǎng)程生理鹽水腹腔注射對(duì)照組嬰幼鼠額葉皮層神經(jīng)細(xì)胞(×400,HE 染色)Figure2-1 the normal cells in the frontal cortex ofbaby rat treated with saline by intraperitonealinjection for long term (×400，，HE staining)圖 2-2 長(zhǎng)程灌胃對(duì)照組嬰幼鼠額葉皮層神經(jīng)細(xì)胞(×400,尼氏染色)Figure2-2 the normal cells in the frontal cortex ofbaby rat orally administrated with CMC for longterm(×400,nissl staining)圖 2-3 長(zhǎng)程小劑量 ACTH 給藥嬰幼鼠額葉皮層神經(jīng)細(xì)胞變性(×400,HE 染色)Figure2-3 neurodegeneration in the frontal cortex ofbaby rat treated with low-dose ACTH for long term(×400, HE staining)圖 2-4 長(zhǎng)程小劑量強(qiáng)的松給藥嬰幼鼠額葉皮層神經(jīng)細(xì)胞變性(×400,尼氏染色)Figure2-4 neurodegeneration in the frontal cortex ofbaby rat treated with low-dose prednisone for longterm(×400,nissl staining)
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類(lèi)號(hào)】：R725.9

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2690541