【摘要】： 高氧機(jī)械通氣是治療嚴(yán)重呼吸衰竭,尤其是急性呼吸窘迫綜合征(Acute respiratory distress syndrome,ARDS)的常用措施,但常時(shí)間暴露在高氧狀態(tài)下會(huì)導(dǎo)致肺上皮細(xì)胞損傷、死亡、致急性肺損傷(acute lung injury, ALI)甚至呼吸功能衰竭。近年支氣管肺發(fā)育不良(bronchopulmonary dysplasia, BPD)在全球發(fā)病率逐年增高,存活者常伴有明顯肺發(fā)育障礙和功能低下,目前國(guó)際上尚無(wú)確定有效的防治方法,但大量臨床資料顯示其病因與高氧性肺損傷密切相關(guān)。 研究發(fā)現(xiàn),高氧性肺損傷早期特征性改變是肺泡炎性水腫,繼之出現(xiàn)肺間質(zhì)增生和纖維化,最終導(dǎo)致呼吸功能的完全喪失。如果早期干預(yù)性治療能使肺水腫液迅速重吸收,就可能改善低氧血癥,減少氧氣的使用濃度和時(shí)間,從而逆轉(zhuǎn)肺損傷,并阻斷后續(xù)的肺間質(zhì)增生和肺組織纖維化。 水通道蛋白(aquaporins, AQPs)是一組與水分子通透有關(guān)的特異型細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,目前發(fā)現(xiàn)在肺組織和氣道至少有4種AQPs(AQP1、AQP3、AQP4、AQP5)的表達(dá)并參與肺液體轉(zhuǎn)運(yùn), AQP5作為肺泡上皮細(xì)胞(AEC)分化的標(biāo)志物之一,對(duì)其在肺泡水代謝的作用機(jī)制是近年來(lái)的研究熱點(diǎn)。多項(xiàng)研究表明在肺部炎癥、水腫狀態(tài)下AQP5基因表達(dá)失衡,提示AQP5在肺泡細(xì)胞的水平衡調(diào)節(jié)上有重要的作用。因而我們推測(cè)高氧性肺損傷肺泡炎性水腫可能存在氧自由基攻擊導(dǎo)致AQP5的基因表達(dá)調(diào)控失衡,從而導(dǎo)致肺水腫時(shí)肺泡液體清除率(Alveolar fluid clearance,AFC)下降。 絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinases, MAPK)是活性氧自由基(reacive oxygen species,ROS)調(diào)節(jié)基因表達(dá)的重要途徑之一,主要包括三類亞族:細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶(Extracellular signal-regulated kinase,ERK)、p38、c-氨基末端激酶/應(yīng)激激活蛋白激酶(c-Jun N-terminal kinase /Stress-activated protein kinase,JNK/SAPK)。MAPK通過(guò)調(diào)節(jié)大量不同效應(yīng)蛋白的磷酸化作用,最終導(dǎo)致基因表達(dá)改變。有依據(jù)顯示AQPs表達(dá)可被生長(zhǎng)因子、炎癥介質(zhì)、滲透性應(yīng)激所調(diào)節(jié),同時(shí)研究還揭示了不同應(yīng)激情況下AQPs基因表達(dá)與MAPK信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)之間存在一定的相關(guān)性,但是對(duì)于氧化應(yīng)激時(shí)AQPs與MAPK二者的關(guān)系,MAPK途徑是否參與高氧性肺損傷中AQPs的表達(dá)調(diào)控,至今尚不清楚。 綜上所述,ROS作為重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子,可能通過(guò)MAPK途徑參與高氧性肺損傷中AQP5的表達(dá)調(diào)控,通過(guò)調(diào)控ROS水平或針對(duì)MAPK激酶途徑進(jìn)行干預(yù),進(jìn)而促進(jìn)肺水腫液迅速重吸收,將是未來(lái)高氧肺損傷和BPD防治的可行性途徑。本課題通過(guò)對(duì)高氧肺損傷肺組織以及肺泡上皮細(xì)胞株AQP5基因表達(dá)進(jìn)行體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)研究,明確其在高氧性肺損傷中的具體作用和意義,并探詢MAPK轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑對(duì)AQP5的調(diào)控機(jī)制。 第一部分MAPK通路對(duì)H2O2刺激狀態(tài)下MLE-12細(xì)胞AQP5表達(dá)的調(diào)控 背景MLE-12是小鼠來(lái)源的肺上皮細(xì)胞株,在研究肺泡上皮細(xì)胞膜蛋白表達(dá)及調(diào)節(jié)方面具有良好的特異性。已有研究證實(shí),暴露于95%氧氣以及H2O2應(yīng)激可觸發(fā)轉(zhuǎn)錄因子AP-1及MAPK家族p38、JNK成員的持續(xù)激活,從而介導(dǎo)高氧所致腫脹性細(xì)胞死亡以及細(xì)胞凋亡,且細(xì)胞的存活率在特異性抑制劑抑制MAPK活化的同時(shí)得到明顯的改善。AQP5在維持肺液體平衡以及肺水腫形成中具有關(guān)鍵性作用,已有脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)及腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor alpha,TNF-α)對(duì)MLE-12細(xì)胞AQP5蛋白及mRNA表達(dá)影響的報(bào)道,但對(duì)于高氧誘導(dǎo)下細(xì)胞AQP5表達(dá)的相關(guān)研究還知之甚少。本研究擬復(fù)制氧化攻擊細(xì)胞模型,研究離體氧化模型AQP5表達(dá)的變化,并通過(guò)MAPK信號(hào)途徑抑制劑阻斷其蛋白激酶的活化,觀察其對(duì)高氧應(yīng)激下MLE-12細(xì)胞AQP5表達(dá)的影響,為急性肺損傷修復(fù)探索新的方法。 目的 1.建立氧化性細(xì)胞模型 2.觀察不同濃度、不同時(shí)間H2O2刺激對(duì)MLE-12細(xì)胞MAPK(ERK、JNK、p38)的影響。 3.觀察不同濃度、不同時(shí)間H2O2刺激對(duì)細(xì)胞AQP5表達(dá)的影響。 4.使用MAPK信號(hào)抑制劑,研究其對(duì)MLE-12細(xì)胞AQP5表達(dá)的影響,探討MAPK途徑是否參與了MLE-12細(xì)胞AQP5的表達(dá)。 方法 1.貼壁培養(yǎng)MLE-12, H2O2作為外源性ROS,選用不同作用濃度(125μM、250μM、500μM、1000μM)H2O2刺激1小時(shí)及250μM H2O2作用不同時(shí)間(0、15min、30min、1h、3h、5h),復(fù)制氧化性細(xì)胞損傷模型。 2. Western blot法檢測(cè)氧化損傷細(xì)胞磷酸化MAPK(ERK、p38、JNK)蛋白表達(dá)并采用相關(guān)抑制劑(分別為PD98059、SB203580、SP600125)阻斷MAPK蛋白表達(dá)。 3.分別用Western blot法和FQ-PCR法檢測(cè)氧化損傷細(xì)胞AQP5蛋白及mRNA基因表達(dá),并選用MAPK信號(hào)通路抑制劑作用細(xì)胞,研究阻斷MAPK信號(hào)途徑表達(dá)后AQP5基因表達(dá)的影響。 結(jié)果 1. MLE-12細(xì)胞磷酸化MAPK蛋白表達(dá)隨H2O2刺激濃度升高而逐漸增加,與對(duì)照組比較,ERK、p38及JNK三亞族在125μM H2O2刺激下蛋白表達(dá)即明顯增加(P0.05),1000μM時(shí)最強(qiáng),呈濃度依賴性。 2. MLE-12細(xì)胞隨H2O2作用時(shí)間延長(zhǎng),磷酸化MAPK蛋白表達(dá)呈上升趨勢(shì),ERK、p38表達(dá)均在H2O2作用1h最強(qiáng),但ERK在作用3h后即降至正常, p38在H2O2 5h后仍高于正常對(duì)照組;JNK蛋白表達(dá)在H2O2作用3h最強(qiáng),第5h與正常對(duì)照組比較無(wú)明顯差異。 3.選用ERK抑制劑PD98059 20μM、p38抑制劑SB203580 20μM、JNK抑制劑SP600125 25μM均能抑制磷酸化ERK、p38、JNK蛋白表達(dá)。 4. Western blot結(jié)果顯示:對(duì)照組AQP5蛋白呈陽(yáng)性表達(dá),在250μM H2O2刺激時(shí)即表達(dá)降低,后隨濃度增加呈逐漸降低趨勢(shì);在250μM H2O2氧化刺激不同時(shí)間時(shí),AQP5蛋白表達(dá)總體呈降低趨勢(shì)。不同MAPK抑制劑干預(yù)組僅見(jiàn)SB203580組AQP5蛋白表達(dá)較相應(yīng)H2O2刺激組增高。 5. FQ-PCR結(jié)果顯示:隨H2O2刺激濃度增高,AQP5 mRNA表達(dá)呈逐漸降低趨勢(shì),以500μM H2O2刺激時(shí)表達(dá)最低;在250μM H2O2作用不同時(shí)間,AQP5mRNA水平隨氧化攻擊時(shí)間的延長(zhǎng)總體呈降低趨勢(shì)。MAPK抑制劑干預(yù)組僅見(jiàn)SB203580組對(duì)AQP5mRNA表達(dá)有影響。 結(jié)論 采用不同濃度及不同作用時(shí)間H2O2攻擊MLE-12作為研究高氧應(yīng)激的體外細(xì)胞模型,H2O2能觸發(fā)MAPK信號(hào)家族ERK、p38、JNK的激活,信號(hào)通路抑制劑可有效抑制三亞族的蛋白表達(dá);H2O2使MLE-12細(xì)胞AQP5 mRNA及蛋白表達(dá)呈降低趨勢(shì),抑制MAPK信號(hào)途徑中p38的表達(dá)可阻斷氧化應(yīng)激狀態(tài)下AQP5基因表達(dá)的降低。 第二部分MAPK通路對(duì)高氧肺損傷動(dòng)物肺組織AQP5表達(dá)的調(diào)控 背景 急性肺損傷(ALI)及急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)起病急驟,發(fā)病持續(xù),是多種高危因素引起的臨床危重疾病。近年來(lái)炎癥反應(yīng)在ALI及ARDS發(fā)病中的地位受到越來(lái)越多的關(guān)注。氧自由基是重要的炎癥介質(zhì),多形核白細(xì)胞(polymorphonuclear neutrophil,PMN)、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、嗜酸粒細(xì)胞均能產(chǎn)生氧自由基,并參與肺損傷。隨著活性氧概念的擴(kuò)展和延伸,氧氣在廣義上也屬于活性氧的范疇。吸入高濃度氧導(dǎo)致急性肺損傷在臨床中屢有發(fā)生,盡管大量的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究顯示在肺損傷和肺水腫形成中AQP5發(fā)揮著重要作用,但對(duì)于高氧性肺損傷中AQP5的研究資料有限,對(duì)MAPK信號(hào)通路與高氧肺損傷二者相關(guān)性的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究少有報(bào)道。本試驗(yàn)擬建立高氧誘導(dǎo)ALI模型,探討AQP5在高氧誘導(dǎo)ALI的表達(dá)變化,并通過(guò)阻斷MAPK信號(hào)通路,研究其對(duì)AQP5基因表達(dá)的影響,探明MAPK信號(hào)通路參與高氧誘導(dǎo)ALI調(diào)節(jié)AQP5的可能性,為有效控制AQP5在肺損傷的表達(dá)失衡提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 目的 1.建立幼鼠高氧誘導(dǎo)ALI模型。 2.觀察高氧暴露對(duì)肺組織MAPK(ERK、p38、JNK)的影響并摸索在體動(dòng)物有效抑制MAPK蛋白表達(dá)的抑制劑濃度。 3.觀察高氧暴露對(duì)肺組織AQP5基因表達(dá)的影響,并應(yīng)用MAPK通路抑制劑,干預(yù)前后進(jìn)行對(duì)比分析,探討AQP5的分子調(diào)控機(jī)制。 方法 1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組:幼年3周齡Wistar大鼠,隨機(jī)分為如下各組(n=6):A組,空氣對(duì)照組;O3組,高氧暴露3天組;O7組,高氧暴露7天組;O14組,高氧暴露14天組;O7+PD組,靜脈注射ERK抑制劑PD98059后行高氧暴露7天;O7+SB組,靜脈注射p38抑制劑SB203580后行高氧暴露7天;O7+SP組,腹腔注射JNK抑制劑SP600125后行高氧暴露7天;且同時(shí)設(shè)立抑制劑對(duì)照組(A+PD組、A+SB組、A+SP組)。 2. Western blot檢測(cè)肺組織磷酸化MAPK(ERK、p38、JNK)蛋白表達(dá),并探討在體實(shí)驗(yàn)中抑制劑阻斷MAPK蛋白表達(dá)的有效濃度;免疫組化分析MAPK蛋白在肺組織的分布。 3.分別用Western blot法和IHC法檢測(cè)高氧肺損傷肺組織AQP5蛋白表達(dá),FQ-PCR法分析AQP5 mRNA基因表達(dá)。并選用MAPK抑制劑阻斷MAPK蛋白表達(dá),研究其對(duì)AQP5基因表達(dá)的影響。 結(jié)果 1.高氧誘導(dǎo)ALI的建立:實(shí)驗(yàn)動(dòng)物置于高氧艙中,連續(xù)行氧濃度監(jiān)測(cè),保證氧濃度≥95%,高氧暴露組動(dòng)物肺組織出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、水腫、出血、肺泡結(jié)構(gòu)破壞等肺損傷病理改變。 2.與空氣對(duì)照組比較,各高氧暴露組ERK、p38、JNK蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng),phospho-ERK、phospho-JNK在O7組表達(dá)升高最為明顯(P0.05),phospho-p38在O14組表達(dá)最強(qiáng)(P0.05);抑制劑PD98059在靜脈注射0.3mg/kg時(shí)即表現(xiàn)出對(duì)ERK蛋白表達(dá)的抑制作用,而靜脈注射SB203580 0.2mg/kg、腹腔注射SP600125 15mg/kg可有效抑制p38、JNK的蛋白表達(dá),且抑制效應(yīng)隨抑制劑濃度的遞增呈增強(qiáng)趨勢(shì)。 3.空氣對(duì)照組僅肺泡上皮細(xì)胞及氣道上皮細(xì)胞少量磷酸化MAPK陽(yáng)性表達(dá),高氧肺損傷各組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯增多,廣泛分布在肺內(nèi)不同細(xì)胞類型中,其中p38陽(yáng)性表達(dá)尤多見(jiàn)于浸潤(rùn)炎性細(xì)胞。 4. AQP5主要表達(dá)于肺泡I型上皮細(xì)胞及氣道分泌上皮頂質(zhì)膜,與空氣對(duì)照組比較,高氧損傷各組陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)明顯減少;Western blot分析見(jiàn)AQP5蛋白表達(dá)隨高氧暴露時(shí)間的延長(zhǎng)呈降低趨勢(shì),尤以O(shè)7組最為明顯;AQP5mRNA也隨高氧暴露時(shí)間增加而逐漸下調(diào)。 5. MAPK抑制劑干預(yù)后,O7+SB203580、O7+SP600125組肺組織病理形態(tài)有明顯改善,且其AQP5蛋白及mRNA表達(dá)較高氧損傷組增加;而PD98059抑制劑組未見(jiàn)干預(yù)前后高氧肺損傷肺組織AQP5基因表達(dá)的變化。 結(jié)論 成功復(fù)制幼年Wistar大鼠高氧誘導(dǎo)ALI模型,高氧暴露可激活MAPK信號(hào)通路ERK/p38/JNK,選用抑制劑適當(dāng)濃度即可有效阻斷MAPK的蛋白活性;高氧肺損傷時(shí)AQP5蛋白及mRNA表達(dá)降低,三種抑制劑(PD98059/SB203580/SP600125)干預(yù)組可見(jiàn)p38抑制劑、JNK抑制劑上調(diào)高氧肺損傷時(shí)AQP5基因表達(dá),因此在體實(shí)驗(yàn)研究表明p38、JNK參與了高氧誘導(dǎo)ALI模型AQP5基因表達(dá)的調(diào)節(jié)。
【圖文】：

1-28 MLE-12 細(xì)胞總 RNA 瓊脂garose gel electrophresis of the totPCR 擴(kuò)增結(jié)果R 擴(kuò)增，其 PCR 產(chǎn)物經(jīng) 1.5%3bp 處 β-actin 清晰條帶，表明引28S18S5

72圖 1-31 MLE-12 細(xì)胞 AQP5 熒光定量 PCR 擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig 1-31 FQ-PCR standard curve of AQP5 in MLE-12 cells-12 細(xì)胞 AQP5 在不同處理因素下其 mRNA 表達(dá)量的變化度 H2O2刺激 MLE-12 細(xì)胞 1 小時(shí) AQP5 的 mRNA 表達(dá)量 PCR 結(jié)果顯示：隨 H2O2刺激濃度增高，AQP5 mRNA 表達(dá)逐漸降低M H2O2表達(dá)最低，，1000 μM H2O2時(shí)稍有回升，但仍明顯低于正常對(duì)照組5）。見(jiàn)圖 1-32、圖 1-34、表 1-3。
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號(hào)】：R720.597

【引證文獻(xiàn)】

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1 黃曉佩;不同氧濃度對(duì)LPS誘導(dǎo)的肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞水通道蛋白-5的影響[D];中南大學(xué);2012年

本文編號(hào)：2687826