【摘要】： 高氧機械通氣是治療嚴重呼吸衰竭,尤其是急性呼吸窘迫綜合征(Acute respiratory distress syndrome,ARDS)的常用措施,但常時間暴露在高氧狀態(tài)下會導致肺上皮細胞損傷、死亡、致急性肺損傷(acute lung injury, ALI)甚至呼吸功能衰竭。近年支氣管肺發(fā)育不良(bronchopulmonary dysplasia, BPD)在全球發(fā)病率逐年增高,存活者常伴有明顯肺發(fā)育障礙和功能低下,目前國際上尚無確定有效的防治方法,但大量臨床資料顯示其病因與高氧性肺損傷密切相關。 研究發(fā)現(xiàn),高氧性肺損傷早期特征性改變是肺泡炎性水腫,繼之出現(xiàn)肺間質(zhì)增生和纖維化,最終導致呼吸功能的完全喪失。如果早期干預性治療能使肺水腫液迅速重吸收,就可能改善低氧血癥,減少氧氣的使用濃度和時間,從而逆轉(zhuǎn)肺損傷,并阻斷后續(xù)的肺間質(zhì)增生和肺組織纖維化。 水通道蛋白(aquaporins, AQPs)是一組與水分子通透有關的特異型細胞膜轉(zhuǎn)運蛋白,目前發(fā)現(xiàn)在肺組織和氣道至少有4種AQPs(AQP1、AQP3、AQP4、AQP5)的表達并參與肺液體轉(zhuǎn)運, AQP5作為肺泡上皮細胞(AEC)分化的標志物之一,對其在肺泡水代謝的作用機制是近年來的研究熱點。多項研究表明在肺部炎癥、水腫狀態(tài)下AQP5基因表達失衡,提示AQP5在肺泡細胞的水平衡調(diào)節(jié)上有重要的作用。因而我們推測高氧性肺損傷肺泡炎性水腫可能存在氧自由基攻擊導致AQP5的基因表達調(diào)控失衡,從而導致肺水腫時肺泡液體清除率(Alveolar fluid clearance,AFC)下降。 絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinases, MAPK)是活性氧自由基(reacive oxygen species,ROS)調(diào)節(jié)基因表達的重要途徑之一,主要包括三類亞族:細胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶(Extracellular signal-regulated kinase,ERK)、p38、c-氨基末端激酶/應激激活蛋白激酶(c-Jun N-terminal kinase /Stress-activated protein kinase,JNK/SAPK)。MAPK通過調(diào)節(jié)大量不同效應蛋白的磷酸化作用,最終導致基因表達改變。有依據(jù)顯示AQPs表達可被生長因子、炎癥介質(zhì)、滲透性應激所調(diào)節(jié),同時研究還揭示了不同應激情況下AQPs基因表達與MAPK信號級聯(lián)反應之間存在一定的相關性,但是對于氧化應激時AQPs與MAPK二者的關系,MAPK途徑是否參與高氧性肺損傷中AQPs的表達調(diào)控,至今尚不清楚。 綜上所述,ROS作為重要的信號轉(zhuǎn)導分子,可能通過MAPK途徑參與高氧性肺損傷中AQP5的表達調(diào)控,通過調(diào)控ROS水平或針對MAPK激酶途徑進行干預,進而促進肺水腫液迅速重吸收,將是未來高氧肺損傷和BPD防治的可行性途徑。本課題通過對高氧肺損傷肺組織以及肺泡上皮細胞株AQP5基因表達進行體內(nèi)、體外實驗研究,明確其在高氧性肺損傷中的具體作用和意義,并探詢MAPK轉(zhuǎn)導途徑對AQP5的調(diào)控機制。 第一部分MAPK通路對H2O2刺激狀態(tài)下MLE-12細胞AQP5表達的調(diào)控 背景MLE-12是小鼠來源的肺上皮細胞株,在研究肺泡上皮細胞膜蛋白表達及調(diào)節(jié)方面具有良好的特異性。已有研究證實,暴露于95%氧氣以及H2O2應激可觸發(fā)轉(zhuǎn)錄因子AP-1及MAPK家族p38、JNK成員的持續(xù)激活,從而介導高氧所致腫脹性細胞死亡以及細胞凋亡,且細胞的存活率在特異性抑制劑抑制MAPK活化的同時得到明顯的改善。AQP5在維持肺液體平衡以及肺水腫形成中具有關鍵性作用,已有脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)及腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor alpha,TNF-α)對MLE-12細胞AQP5蛋白及mRNA表達影響的報道,但對于高氧誘導下細胞AQP5表達的相關研究還知之甚少。本研究擬復制氧化攻擊細胞模型,研究離體氧化模型AQP5表達的變化,并通過MAPK信號途徑抑制劑阻斷其蛋白激酶的活化,觀察其對高氧應激下MLE-12細胞AQP5表達的影響,為急性肺損傷修復探索新的方法。 目的 1.建立氧化性細胞模型 2.觀察不同濃度、不同時間H2O2刺激對MLE-12細胞MAPK(ERK、JNK、p38)的影響。 3.觀察不同濃度、不同時間H2O2刺激對細胞AQP5表達的影響。 4.使用MAPK信號抑制劑,研究其對MLE-12細胞AQP5表達的影響,探討MAPK途徑是否參與了MLE-12細胞AQP5的表達。 方法 1.貼壁培養(yǎng)MLE-12, H2O2作為外源性ROS,選用不同作用濃度(125μM、250μM、500μM、1000μM)H2O2刺激1小時及250μM H2O2作用不同時間(0、15min、30min、1h、3h、5h),復制氧化性細胞損傷模型。 2. Western blot法檢測氧化損傷細胞磷酸化MAPK(ERK、p38、JNK)蛋白表達并采用相關抑制劑(分別為PD98059、SB203580、SP600125)阻斷MAPK蛋白表達。 3.分別用Western blot法和FQ-PCR法檢測氧化損傷細胞AQP5蛋白及mRNA基因表達,并選用MAPK信號通路抑制劑作用細胞,研究阻斷MAPK信號途徑表達后AQP5基因表達的影響。 結(jié)果 1. MLE-12細胞磷酸化MAPK蛋白表達隨H2O2刺激濃度升高而逐漸增加,與對照組比較,ERK、p38及JNK三亞族在125μM H2O2刺激下蛋白表達即明顯增加(P0.05),1000μM時最強,呈濃度依賴性。 2. MLE-12細胞隨H2O2作用時間延長,磷酸化MAPK蛋白表達呈上升趨勢,ERK、p38表達均在H2O2作用1h最強,但ERK在作用3h后即降至正常, p38在H2O2 5h后仍高于正常對照組;JNK蛋白表達在H2O2作用3h最強,第5h與正常對照組比較無明顯差異。 3.選用ERK抑制劑PD98059 20μM、p38抑制劑SB203580 20μM、JNK抑制劑SP600125 25μM均能抑制磷酸化ERK、p38、JNK蛋白表達。 4. Western blot結(jié)果顯示:對照組AQP5蛋白呈陽性表達,在250μM H2O2刺激時即表達降低,后隨濃度增加呈逐漸降低趨勢;在250μM H2O2氧化刺激不同時間時,AQP5蛋白表達總體呈降低趨勢。不同MAPK抑制劑干預組僅見SB203580組AQP5蛋白表達較相應H2O2刺激組增高。 5. FQ-PCR結(jié)果顯示:隨H2O2刺激濃度增高,AQP5 mRNA表達呈逐漸降低趨勢,以500μM H2O2刺激時表達最低;在250μM H2O2作用不同時間,AQP5mRNA水平隨氧化攻擊時間的延長總體呈降低趨勢。MAPK抑制劑干預組僅見SB203580組對AQP5mRNA表達有影響。 結(jié)論 采用不同濃度及不同作用時間H2O2攻擊MLE-12作為研究高氧應激的體外細胞模型,H2O2能觸發(fā)MAPK信號家族ERK、p38、JNK的激活,信號通路抑制劑可有效抑制三亞族的蛋白表達;H2O2使MLE-12細胞AQP5 mRNA及蛋白表達呈降低趨勢,抑制MAPK信號途徑中p38的表達可阻斷氧化應激狀態(tài)下AQP5基因表達的降低。 第二部分MAPK通路對高氧肺損傷動物肺組織AQP5表達的調(diào)控 背景 急性肺損傷(ALI)及急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)起病急驟,發(fā)病持續(xù),是多種高危因素引起的臨床危重疾病。近年來炎癥反應在ALI及ARDS發(fā)病中的地位受到越來越多的關注。氧自由基是重要的炎癥介質(zhì),多形核白細胞(polymorphonuclear neutrophil,PMN)、單核細胞、巨噬細胞、嗜酸粒細胞均能產(chǎn)生氧自由基,并參與肺損傷。隨著活性氧概念的擴展和延伸,氧氣在廣義上也屬于活性氧的范疇。吸入高濃度氧導致急性肺損傷在臨床中屢有發(fā)生,盡管大量的動物實驗研究顯示在肺損傷和肺水腫形成中AQP5發(fā)揮著重要作用,但對于高氧性肺損傷中AQP5的研究資料有限,對MAPK信號通路與高氧肺損傷二者相關性的動物實驗研究少有報道。本試驗擬建立高氧誘導ALI模型,探討AQP5在高氧誘導ALI的表達變化,并通過阻斷MAPK信號通路,研究其對AQP5基因表達的影響,探明MAPK信號通路參與高氧誘導ALI調(diào)節(jié)AQP5的可能性,為有效控制AQP5在肺損傷的表達失衡提供實驗基礎。 目的 1.建立幼鼠高氧誘導ALI模型。 2.觀察高氧暴露對肺組織MAPK(ERK、p38、JNK)的影響并摸索在體動物有效抑制MAPK蛋白表達的抑制劑濃度。 3.觀察高氧暴露對肺組織AQP5基因表達的影響,并應用MAPK通路抑制劑,干預前后進行對比分析,探討AQP5的分子調(diào)控機制。 方法 1.實驗動物分組:幼年3周齡Wistar大鼠,隨機分為如下各組(n=6):A組,空氣對照組;O3組,高氧暴露3天組;O7組,高氧暴露7天組;O14組,高氧暴露14天組;O7+PD組,靜脈注射ERK抑制劑PD98059后行高氧暴露7天;O7+SB組,靜脈注射p38抑制劑SB203580后行高氧暴露7天;O7+SP組,腹腔注射JNK抑制劑SP600125后行高氧暴露7天;且同時設立抑制劑對照組(A+PD組、A+SB組、A+SP組)。 2. Western blot檢測肺組織磷酸化MAPK(ERK、p38、JNK)蛋白表達,并探討在體實驗中抑制劑阻斷MAPK蛋白表達的有效濃度;免疫組化分析MAPK蛋白在肺組織的分布。 3.分別用Western blot法和IHC法檢測高氧肺損傷肺組織AQP5蛋白表達,FQ-PCR法分析AQP5 mRNA基因表達。并選用MAPK抑制劑阻斷MAPK蛋白表達,研究其對AQP5基因表達的影響。 結(jié)果 1.高氧誘導ALI的建立:實驗動物置于高氧艙中,連續(xù)行氧濃度監(jiān)測,保證氧濃度≥95%,高氧暴露組動物肺組織出現(xiàn)炎性細胞浸潤、水腫、出血、肺泡結(jié)構(gòu)破壞等肺損傷病理改變。 2.與空氣對照組比較,各高氧暴露組ERK、p38、JNK蛋白表達明顯增強,phospho-ERK、phospho-JNK在O7組表達升高最為明顯(P0.05),phospho-p38在O14組表達最強(P0.05);抑制劑PD98059在靜脈注射0.3mg/kg時即表現(xiàn)出對ERK蛋白表達的抑制作用,而靜脈注射SB203580 0.2mg/kg、腹腔注射SP600125 15mg/kg可有效抑制p38、JNK的蛋白表達,且抑制效應隨抑制劑濃度的遞增呈增強趨勢。 3.空氣對照組僅肺泡上皮細胞及氣道上皮細胞少量磷酸化MAPK陽性表達,高氧肺損傷各組陽性細胞數(shù)明顯增多,廣泛分布在肺內(nèi)不同細胞類型中,其中p38陽性表達尤多見于浸潤炎性細胞。 4. AQP5主要表達于肺泡I型上皮細胞及氣道分泌上皮頂質(zhì)膜,與空氣對照組比較,高氧損傷各組陽性細胞表達明顯減少;Western blot分析見AQP5蛋白表達隨高氧暴露時間的延長呈降低趨勢,尤以O7組最為明顯;AQP5mRNA也隨高氧暴露時間增加而逐漸下調(diào)。 5. MAPK抑制劑干預后,O7+SB203580、O7+SP600125組肺組織病理形態(tài)有明顯改善,且其AQP5蛋白及mRNA表達較高氧損傷組增加;而PD98059抑制劑組未見干預前后高氧肺損傷肺組織AQP5基因表達的變化。 結(jié)論 成功復制幼年Wistar大鼠高氧誘導ALI模型,高氧暴露可激活MAPK信號通路ERK/p38/JNK,選用抑制劑適當濃度即可有效阻斷MAPK的蛋白活性;高氧肺損傷時AQP5蛋白及mRNA表達降低,三種抑制劑(PD98059/SB203580/SP600125)干預組可見p38抑制劑、JNK抑制劑上調(diào)高氧肺損傷時AQP5基因表達,因此在體實驗研究表明p38、JNK參與了高氧誘導ALI模型AQP5基因表達的調(diào)節(jié)。
【圖文】：

1-28 MLE-12 細胞總 RNA 瓊脂garose gel electrophresis of the totPCR 擴增結(jié)果R 擴增，其 PCR 產(chǎn)物經(jīng) 1.5%3bp 處 β-actin 清晰條帶，表明引28S18S5

72圖 1-31 MLE-12 細胞 AQP5 熒光定量 PCR 擴增標準曲線Fig 1-31 FQ-PCR standard curve of AQP5 in MLE-12 cells-12 細胞 AQP5 在不同處理因素下其 mRNA 表達量的變化度 H2O2刺激 MLE-12 細胞 1 小時 AQP5 的 mRNA 表達量 PCR 結(jié)果顯示：隨 H2O2刺激濃度增高，AQP5 mRNA 表達逐漸降低M H2O2表達最低，，1000 μM H2O2時稍有回升，但仍明顯低于正常對照組5）。見圖 1-32、圖 1-34、表 1-3。
【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2007
【分類號】：R720.597

【引證文獻】

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1 黃曉佩;不同氧濃度對LPS誘導的肺泡Ⅱ型上皮細胞水通道蛋白-5的影響[D];中南大學;2012年

本文編號：2687826