高氧致CLD早產(chǎn)鼠肺細胞凋亡、增殖和間質(zhì)纖維化的動態(tài)變化及其機制研究

發(fā)布時間：2020-05-28 19:16

【摘要】： 前言低氧血癥是合并心肺疾病早產(chǎn)兒最常見的臨床表現(xiàn)，也是導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)不可逆性損害的重要原因之一，因此，臨床醫(yī)生對早產(chǎn)兒低氧血癥均能給予高度警惕和足夠重視。然而恰恰忽視了氧畢竟屬于氣體藥物，若長時間吸入高濃度氧仍可導(dǎo)致不同程度的肺組織損傷，重者可發(fā)生早產(chǎn)兒慢性肺疾病(chronic lung disease，CLD)。雖高吸氣壓力的機械通氣及感染也可導(dǎo)致早產(chǎn)兒CLD，但目前高濃度氧仍被認(rèn)為是CLD發(fā)生的最危險因素及最主要原因。近年來，隨著極低體重兒搶救存活率的提高，其發(fā)病率國外已達30％～40％，而我國也呈逐年上升趨勢。因其發(fā)病機制尚不清楚，故目前仍無有效的監(jiān)控手段及防治措施。以往一直認(rèn)為肺間質(zhì)纖維化是CLD的主要病理變化，而近年來國內(nèi)外學(xué)者均注意到肺發(fā)育障礙已成為影響CLD預(yù)后及早產(chǎn)兒日后生活質(zhì)量的重要因素，故提出肺發(fā)育停滯是CLD的新特征。因此，研究高氧致早產(chǎn)兒CLD發(fā)生中肺形態(tài)學(xué)動態(tài)演變規(guī)律，探索其發(fā)病機制已成為當(dāng)今新生兒領(lǐng)域亟待解決并最具挑戰(zhàn)性的研究課題之一。目前有關(guān)CLD發(fā)生機制的研究多集中于：1)因早產(chǎn)兒體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)尚未發(fā)育成熟，吸入高濃度氧后，大量的氧自由基及活性氧生成，使肺內(nèi)氧化／抗氧化系統(tǒng)失衡，從而導(dǎo)致氧化應(yīng)激性肺損傷；2)病程初期大量炎性細胞(主要是肺泡巨噬細胞)在肺內(nèi)潴留，激活并持續(xù)釋放IL-6、IL-8及TNF-α等前炎癥因子，使中性粒細胞從血管腔遷移、聚集到肺組織，通過釋放氧自由基、蛋白水解酶等而引發(fā)肺部的炎癥反應(yīng)。上述研究側(cè)重闡明了高氧誘導(dǎo)肺損傷的發(fā)生機制，而有關(guān)細胞凋亡是否參與CLD的發(fā)生過程?高氧是抑制還是誘導(dǎo)肺細胞的增殖效應(yīng)?目前結(jié)論各異。而關(guān)于Ⅱ型肺泡上皮細胞(type Ⅱ alveolar epithelial cell，AEC-Ⅱ)在CLD肺上皮重塑中作用如何?肺組織纖維增生的機制等諸多問題，目前研究甚少。本研究以高氧致早產(chǎn)鼠CLD模型為對象，應(yīng)用分子生物學(xué)等檢測技術(shù)，觀察肺形態(tài)的動態(tài)演變過程；研究肺細胞的凋亡及其發(fā)生機制；探索肺細胞增殖的動態(tài)效應(yīng)及其細胞周期的調(diào)控機制;并試圖闡明CLD肺間質(zhì)纖維化的發(fā)生機制。從而為完善早產(chǎn)兒CLD的發(fā)生機制及尋求有效的防治途徑奠定實驗基礎(chǔ)。材料與方法一、動物模型實驗組將早產(chǎn)的SD大鼠(連同代母鼠)生后即置于氧箱中，持續(xù)輸人氧氣，維持Fio:為0.90(美國oM一SME型測氧儀監(jiān)測)，用鈉石灰吸收 CO:，使其濃度0.5%(Dapex氣體分析儀)，溫度22℃一25℃，濕度50%- 70%，每天定時開箱0.sh，添加水、飼料及更換墊料，并與對照組交換母鼠以避免因氧中毒而致喂養(yǎng)能力下降。對照組FIO:為0.21(即空氣)，具體方法及實驗控制因素同實驗組。二、實驗標(biāo)本采集及處理分別于實驗后的ld、3d、7d、14d和21d隨機處死后分離肺組織。用于肺形態(tài)學(xué)觀察、免疫組織化學(xué)、原位雜交及脫氧核糖核昔酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo) 的原位缺口末端標(biāo)記(TUNEL)檢測的標(biāo)本置于4%多聚甲醛中固定;用于超微結(jié)構(gòu)觀察的標(biāo)本置于2.5%戊二醛中固定;用于酶聯(lián)免疫吸附法(en- zyme linked immunoadsothent，ELISA)和反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverse tran- seription polymerase ehain reaetion，RT一PCR)檢測的標(biāo)本置于Eppendorf管中，，于一0℃冰箱中凍存。三、實驗方法及檢測指標(biāo) 1.肺形態(tài)的研究 l)光鏡下觀察:①觀察肺組織的病理變化;②放射狀肺泡計數(shù)(radic公滋vealar counts，RAC);③肺泡面積/肺間隔面積(燈s)(美國Universal Ima- gingPo印oration圖像分析系統(tǒng))④觀察肺組織內(nèi)的膠原沉積(vG染色)。 2)透射電鏡下:觀察AEC一11表面微絨毛(Mv)、細胞質(zhì)內(nèi)線粒體(Mi) 及板層小體(LB)變化。 2.肺細胞凋亡及其機制研究 1) TUNEL技術(shù):觀察肺細胞凋亡指數(shù)(apoptosis index，AI)。 2)免疫組織化學(xué)技術(shù)(SABC法):測定肺組織Bax及Bcl一基因蛋白表達。 3)RT一PCR技術(shù):測定肺組織Caspase一mRNA表達。 3.肺細胞增殖及其機制的研究 l)免疫組織化學(xué)技術(shù)(SABC法):觀察增殖性細胞核抗原(proliferating eell nuelear anu羅n，pCNA)指數(shù)。 2)原位雜交技術(shù):測定肺組織細胞周期蛋白依賴激酶一(cyclin depend- entk訪ase，CDKZ)CDKZ InRNA表達。 3)RT·PCR技術(shù):一測定肺組織肺表面活性蛋白A、B( plumon田嘆SUlfactant protein，SP一A、SP‘B)及水通道蛋白一(Aquapo血，AQP-5)基因表達。 4.肺間質(zhì)纖維化發(fā)生機制的研究 1) EllSA方法:測定肺組織I型膠原、纖維連接蛋白(fibronectin，F(xiàn)N) 及透明質(zhì)酸(場公uronicac記，HA)含量。 2)免疫組織化學(xué)技術(shù)(SABC法):測定肺組織轉(zhuǎn)化生長因子p，(trans- fo耐nggro袖faetor一p:，TGF一p:)蛋白表達。 3)RT一PCR技術(shù):測定肺組織TGF一p:、基質(zhì)金屬蛋白酶名(matrix met沮- loproteinases，MMp名)及其組織抑制因子一l(tissue inhibitor of metalloprotein- ase。，nMp一l)基因表達。四、統(tǒng)計學(xué)分析應(yīng)用SPSS ro.o統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理，所有數(shù)據(jù)均以又士s表示，組間比較采用Dunnettt檢驗，相關(guān)
【圖文】：

肺組織,二基,蛋白表達,血漿