【摘要】： 第一部分不同日齡新生小鼠視網(wǎng)膜血管對氧療的敏感性 目的：給不同日齡新生小鼠吸氧，觀察日齡對氧療的敏感性，研究視網(wǎng)膜血管的發(fā)育程度與新生血管形成的關系。 方法：選擇4、7、9、11日齡C57BL/6J新生小鼠各48只，分別分為高氧組和空氣組，高氧組給予吸入75％氧氣5天后返回到空氣中，空氣組置于同實驗條件下的空氣中。通過視網(wǎng)膜鋪片和視網(wǎng)膜切片定性和定量的研究，觀察視網(wǎng)膜血管的變化。視網(wǎng)膜鋪片經(jīng)ADP酶染色，觀察視網(wǎng)膜血管形態(tài)的改變；視網(wǎng)膜切片經(jīng)常規(guī)HE染色，計數(shù)突破視網(wǎng)膜內(nèi)界膜的新生血管內(nèi)皮細胞核數(shù)目，定量觀察視網(wǎng)膜血管的增生情況。 結果：與各空氣組相比，4、7、9日齡高氧組小鼠吸高氧5天后(出氧箱當天)，視網(wǎng)膜鋪片顯示血管明顯收縮、阻塞，視網(wǎng)膜中央大片無灌注區(qū)；返回空氣第2天，新生血管開始形成；第5天，新生血管形成達到高峰。而11日齡高氧組小鼠在返回空氣第5天未見新生血管形成。4、7、9、11日齡高氧組小鼠出氧箱第5天突破視網(wǎng)膜內(nèi)界膜的血管內(nèi)皮細胞核數(shù)目分別為25.0±3.7、47.7±5.0、18.7±2.0、2.6±1.4個，4、7、9、11日齡空氣組分別為0.7±1.1、1.2±1.2、0.8±1.0、1.6±1.0個，4、7、9日齡高氧組細胞核數(shù)目明顯增多，與相應的空氣組比較，差異有顯著意義(P＜0.01)；11日齡高氧組細胞核數(shù)無明顯增多，與11日齡空氣組比較，差異無顯著意義(P=0.07)。7日齡高氧組細胞核數(shù)目最多，，與4、9、11同齡高氧組比較差異有顯著意義(P＜0.01)。 結論：4、7、9日齡C57BL/6J新生小鼠視網(wǎng)膜血管對氧療敏感，吸75％氧5天后發(fā)生了類似人類ROP的視網(wǎng)膜病變，其中7目齡新生小鼠病變最嚴重，是制備ROP的最理想動物模型。11日齡新生小鼠吸75％氧5天后未發(fā)生視網(wǎng)膜病變。視網(wǎng)膜血管的發(fā)育程度與新生血管形成有關，視網(wǎng)膜血管發(fā)育越不成熟越易發(fā)生視網(wǎng)膜病變，而發(fā)育成熟的視網(wǎng)膜則不會發(fā)生視網(wǎng)膜病變。 第二部分不同吸氧方式對新生小鼠視網(wǎng)膜血管發(fā)育的影響及在視網(wǎng)膜病變發(fā)病中的作用 目的：研究不同吸氧方式對新生小鼠視網(wǎng)膜血管發(fā)育的影響及在視網(wǎng)膜病變發(fā)病中的作用，為早產(chǎn)兒臨床合理用氧提供實驗依據(jù)。 方法：選擇7日齡C57BL/6J新生小鼠720只，隨機分為6組，每組120只。具體分組如下：緩升驟停組：FiO_2由30％逐漸升高至75％后突然中斷吸氧；暫高緩停組：吸75％氧1天，然后逐漸降低FiO_2直至停氧；高氧驟停組：吸75％高氧5天后驟然停氧；高氧緩停組：吸75％高氧5天后逐漸降低FiO_2直至停氧；高氧波動組：FiO_2波動較大，隔天吸75％高氧和空氣共6天；對照組：置于同實驗條件下的空氣中。觀察各組視網(wǎng)膜血管改變：視網(wǎng)膜鋪片經(jīng)ADP酶染色，觀察視網(wǎng)膜血管形態(tài)的動態(tài)改變；視網(wǎng)膜切片經(jīng)常規(guī)HE染色，計數(shù)每只小鼠每張切片上突破視網(wǎng)膜內(nèi)界膜的新生血管內(nèi)皮細胞核數(shù)目，定量觀察視網(wǎng)膜血管的增生情況。各組P7—P21隔天剝離視網(wǎng)膜，采用實時熒光定量PCR法檢測各組小鼠視網(wǎng)膜VEGF、PEDF和IGF-1 mRNA表達水平，各組P7—P21隔天取小鼠摘取眼球，制備切片，采用免疫組化法檢測各組小鼠視網(wǎng)膜VEGF、PEDF蛋白水平的變化。 結果：1．視網(wǎng)膜鋪片：對照組，P12見少量無灌注區(qū)，周邊血管結構清晰，P14無灌注區(qū)消失，血管形態(tài)基本正常，P17血管形態(tài)全部正常。緩升驟停組、高氧驟停組、高氧波動組，P12視網(wǎng)膜中央部有大片無灌注區(qū)，血管收縮、閉塞，P14新生血管開始形成，P17大量新生血管形成。高氧緩停組，P14視網(wǎng)膜中央部大片無灌注區(qū)，有少量新生血管形成，P17無灌注區(qū)縮小，血管走行基本正常，深層血管有阻塞，P22血管發(fā)育基本正常。暫高緩停組鋪片顯示視網(wǎng)膜血管形態(tài)與對照組相似。2．視網(wǎng)膜切片：緩升驟停組、暫高緩停組、高氧驟停組、高氧緩停組、高氧波動組小鼠突破視網(wǎng)膜內(nèi)界膜的新生血管內(nèi)皮細胞核的數(shù)目分別為49.5±1.4、5.2±0.7、47.7±4.7、5.7±2.4、29.2±2.5個，對照組為1.2±0.2個，緩升驟停組、高氧驟停組、高氧波動組細胞核數(shù)明顯增多，與對照組比較差異有顯著意義(P=0.000)；暫高緩停組、高氧緩停組細胞核數(shù)無明顯增多，與對照組比較差異無顯著意義(P值分別為0.226和0.442)。各實驗組之間相互比較，緩升驟停組、高氧驟停組細胞核數(shù)目明顯增多，分別與暫高緩停組和高氧緩停組比較，差異有顯著意義(P＜0.05)。3．視網(wǎng)膜VEGF的改變：對照組新生小鼠VEGF mRNA于P7上升，P11達高峰，此后下降，P13降至最低水平，并始終維持低水平。緩升驟停組、高氧驟停組、高氧波動組VEGF mRNA P7開始下降，在整個吸氧期持續(xù)降低，P11降至最低水平，至出氧箱后緩慢上升，P15顯著上升，與對照組比較差異有顯著意義，受氧濃度的調(diào)節(jié)非常明顯。暫高緩停組VEGF mRNA變化趨勢與對照組一致。高氧緩停組VEGF mRNA P9顯著下降，在整個高氧階段持續(xù)降低，P11降至最低水平，隨著氧濃度的降低，P13稍有上升，但與對照組相比差異無顯著意義。VEGF蛋白水平變化趨勢與mRNA水平一致。4．視網(wǎng)膜PEDF的改變：對照組新生小鼠PEDF mRNA P7逐漸上升，P13升至最高水平，此后稍有下降，但仍在較高水平。緩升驟停組、高氧驟停組、高氧波動組PEDF mRNA P7逐漸上升，三組分別于P13、P11、P11升至最高水平，出氧箱后逐漸下降，P15顯著下降，與對照組比較差異有顯著意義，受氧濃度調(diào)節(jié)明顯。暫高緩停組PEDF mRNA變化趨勢與對照組一致。高氧緩停組PEDF mRNA P9顯著上升，P11升至最高水平，隨著氧濃度的降低，無顯著下降。PEDF蛋白水平的變化趨勢與mRNA水平一致。5．視網(wǎng)膜IGF-1的變化：對照組新生小鼠IGF-1 mRNA P7逐漸下降，P15顯著下降，為P7的0.8，并維持此水平至P21。緩升驟停組、高氧驟停組、高氧波動組IGF-1 mRNA于P7逐漸下降，P11降至最低水平，P13明顯上升，三組分別于P15、P17、P17升至最高峰，與對照組比較差異有顯著意義，此后逐漸下降，P21降至較低水平。暫高緩停組IGF-1 mRNA P7逐漸下降，P21降至最低，為P7的0.8，各時間點與對照組相比差異無顯著意義。高氧緩停組IGF-1 mRNA P7逐漸下降，P11降至最低值，P15升至最高水平，與對照組比較差異有顯著意義，此后逐漸下降，P21降至最低值。 結論：1．不同吸氧方式對視網(wǎng)膜血管發(fā)育產(chǎn)生不同的影響，吸入氧濃度波動較大、吸入高濃度氧后突然停氧可嚴重影響新生小鼠視網(wǎng)膜血管的發(fā)育，形成新生血管，產(chǎn)生類似早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病的病變。因此臨床上應盡早穩(wěn)定早產(chǎn)兒的生命體征，減少氧療，嚴密監(jiān)測用氧情況，采取逐漸降低氧濃度的吸氧方式，并盡量避免氧濃度波動過大。2．VEGF、PEDF和IGF-1共同參與新生血管形成的調(diào)節(jié)，VEGF促進新生血管形成，而PEDF抑制新生血管形成。高氧下調(diào)VEGF表達，上調(diào)PEDF表達，使VEGF/PEDF比值下降；而低氧則正好相反，使VEGF/PEDF比值上升，促進新生血管形成。IGF-1對維持正常視網(wǎng)膜血管發(fā)育起重要作用，并與VEGF共同促進新生血管形成。 第三部分補氧對新生小鼠視網(wǎng)膜病變新生血管的影響 目的：對已發(fā)生視網(wǎng)膜病變的新生小鼠繼續(xù)使用不同濃度的氧氣，觀察視網(wǎng)膜血管的變化，為臨床上已發(fā)生ROP病變患兒的氧療提供實驗依據(jù)。 方法：7日齡C57BL/6J新生小鼠210只，根據(jù)不同的補氧方案將新生小鼠分為8組。非補氧組：小鼠吸75％高氧5d，出氧箱后返回到空氣中；30％、50％、75％補氧組：小鼠吸75％高氧5d后，再分別吸入30％、50％、75％O_2各5天；間斷30％、50％、75％補氧組：小鼠吸75％高氧5d后停氧2d，再分別吸入30％、50％、75％O_2各5天；對照組置于同實驗條件下的空氣中。觀察各組視網(wǎng)膜血管改變：視網(wǎng)膜鋪片經(jīng)ADP酶染色，觀察視網(wǎng)膜血管形態(tài)的動態(tài)改變；視網(wǎng)膜切片經(jīng)常規(guī)HE染色，計數(shù)每只小鼠每張切片上突破視網(wǎng)膜內(nèi)界膜的新生血管內(nèi)皮細胞核數(shù)目，定量觀察視網(wǎng)膜血管的增生情況。 結果：1．視網(wǎng)膜鋪片：對照組，P12見少量無灌注區(qū)，周邊血管結構清晰，P14無灌注區(qū)消失，血管形態(tài)基本正常，P17起血管形態(tài)全部正常。非補氧組，P12視網(wǎng)膜中央部有大片無灌注區(qū)，血管收縮、閉塞，P14新生血管開始形成，P17大量新生血管形成。30％補氧組，P17見大片無灌注區(qū)，開始出現(xiàn)新生血管，P19、P22有大量新生血管形成。50％、75％補氧組，P17見少量無灌注區(qū)，血管分支少，走行僵直，P19無灌注區(qū)消失，大血管管徑、分支、走行均基本正常，僅見深層血管有阻塞現(xiàn)象，P22血管發(fā)育基本成熟，可見兩層血管網(wǎng)結構。間斷30％補氧組，P19少量新生血管，P21、P24血管網(wǎng)結構紊亂，大量新生血管形成。間斷50％、75％補氧組，P19見少量無灌注區(qū)，血管分支、管徑、走行基本正常，深層血管有阻塞現(xiàn)象，P21無灌注區(qū)消失，血管發(fā)育基本成熟，P24血管發(fā)育完全成熟，兩層血管網(wǎng)結構清晰。2．視網(wǎng)膜切片：非補氧組，30％、50％、75％補氧組，間斷30％、50％、75％補氧組小鼠突破視網(wǎng)膜內(nèi)界膜的新生血管內(nèi)皮細胞核分別為47.7±5.2、24.9±4.0、2.6±1.5、3.8±2.2、31.1±4.8、2.0±1.5、8.9±3.1個，對照組為1.2±1.1個。非補氧組、30％、間斷30％補氧組細胞核數(shù)目明顯增多，與對照組比較差異有顯著意義(P＜0.05)；50％、75％補氧組、間斷50％、75％補氧組細胞核數(shù)目無明顯增多，與對照組比較差異無顯著意義(P值分別為0.688，0.446，0.809，0.24)。各實驗組之間相互比較，非補氧組細胞核數(shù)目最多，與50％、75％補氧組、間斷50％、75％補氧組比較差異有顯著意義(P＜0.05)；與30％補氧組、間斷30％補氧組比較差異無顯著意義(P值分別為0.07，0.058)。 結論：1．在ROP形成第一階段后即第二階段初始給予適當吸氧可抑制新生血管形成，減輕視網(wǎng)膜病變，但這是很有爭議的問題，在臨床上如何掌握具體補氧方法，有待于進一步研究。2．吸入高氧后驟然停氧會促進視網(wǎng)膜新生血管形成，在臨床工作中吸入高氧后應逐漸減低吸入氧濃度，盡量避免氧濃度尤其血氧分壓的過度波動。
【圖文】：

每只眼球每張切片突破視網(wǎng)膜內(nèi)界膜的血管內(nèi)皮細胞核數(shù)。選取切片時避開視乳頭周圍;計數(shù)血管內(nèi)皮細胞核時僅計數(shù)與內(nèi)界膜有緊密聯(lián)系的細胞核，不包括玻璃體腔內(nèi)其它與內(nèi)界膜無聯(lián)系血管內(nèi)皮細胞核。(圖1一l)圖1一1新生小鼠視網(wǎng)膜組織切片(HE，x400倍)箭頭表示突破視網(wǎng)膜內(nèi)界膜的血管內(nèi)皮細胞核四.統(tǒng)計學分析所有數(shù)據(jù)均以統(tǒng)計分析軟件 SPSS11.5forwindows進行分析，采用非配對t檢驗方法比較各高氧組與空氣組突破視網(wǎng)膜內(nèi)界膜的新生血管內(nèi)皮細胞核數(shù)目。數(shù)據(jù)以(X士S)表示，P<0.05為統(tǒng)計學有顯著意義。

0.7士1.147.7士5.01.2士1.218.7士2.00.8士1.02.6士1.41.6士1.00.0000.0000.074日齡空氣組7日齡高氧組7日齡空氣組9日齡高氧組9日齡空氣組n日齡高氧組n日齡空氣組注:*表示與相應空氣組比較P值表1一3各高氧組突破內(nèi)界膜的血管內(nèi)皮細胞核數(shù)目比較(P值)組別4日齡高氧組7日齡高氧組9日齡高氧組7日齡高氧組9日齡高氧組11日齡高氧組0.0000.0000.0000.0000.0000.368八b
【學位授予單位】：復旦大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2006
【分類號】：R722.6;R774.1

【參考文獻】

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本文編號：2680447