【摘要】： 1.研究目的 兒童股骨頭缺血性壞死,也稱Legg-Calve-Perthes病,是骨科的疑難雜病之一,在1910年前后分別由Legg、Calve、Perthes報(bào)道后,國(guó)內(nèi)外已進(jìn)行各個(gè)方面的研究,一直在不斷加深對(duì)其認(rèn)識(shí)中。兒童股骨頭壞死的病因存在多種學(xué)說,在研究?jī)和晒穷^壞死治療方法過程中,針對(duì)其可能病因的治療方法有了很多的報(bào)道,但是針對(duì)不能肯定的病因而設(shè)計(jì)的手術(shù),有無必要,有無作用和副作用等問題有待深思,有待進(jìn)行大量病例的長(zhǎng)期隨訪和科學(xué)的療效評(píng)價(jià),現(xiàn)多數(shù)學(xué)者主張病因未明確前不宜選用創(chuàng)傷大過程復(fù)雜的手術(shù)。 祖國(guó)醫(yī)學(xué)認(rèn)為該病病機(jī)為肝腎不足,髓�？仗�,不能滋養(yǎng)骨骼,如存在感受外邪等誘因,致使瘀血凝滯,經(jīng)脈受阻,氣血不通,這也是股骨頭壞死的發(fā)病機(jī)理。股骨頭壞死關(guān)鍵在于缺血。腎陰虧損、氣滯血瘀是兒童股骨頭壞死的常見病機(jī),治療上應(yīng)以補(bǔ)益肝腎,活血化瘀,行氣止痛為法。中藥生脈成骨膠囊是治療股骨頭壞死的藥物,在實(shí)驗(yàn)和臨床上已經(jīng)做了大量的研究,可以改善微循環(huán)、抑制細(xì)胞成脂、促進(jìn)血管生成,治療股骨頭壞死具有較好的療效。 根據(jù)病理改變的規(guī)律設(shè)計(jì)的治療方法,已經(jīng)受到國(guó)內(nèi)外眾多學(xué)者的重視,在自然修復(fù)的整個(gè)病理過程中,積極地采取避免股骨頭變形的措施,比如髖外展支架,截骨包容法,可以根據(jù)生物性塑形使得髖關(guān)節(jié)達(dá)到匹配,具有較好的療效和應(yīng)用前景。 骨髓間質(zhì)干細(xì)胞因其本身具有強(qiáng)大增殖能力和多向分化潛能,在修復(fù)創(chuàng)傷領(lǐng)域研究具有重要的意義。 本論文擬研究分離培養(yǎng)骨髓間質(zhì)干細(xì)胞,然后采用補(bǔ)腎活血化瘀中藥生脈成骨膠囊進(jìn)行培養(yǎng),觀察對(duì)骨髓干細(xì)胞是否有增殖作用和促進(jìn)成骨,初步分析這種作用可能是該藥的作用機(jī)理之一。再回顧性研究對(duì)比多種方法處理兒童股骨頭壞死的結(jié)果,即未系統(tǒng)治療、髖外展支架治療、中藥配合支架治療并進(jìn)行初步分析,試探討用中藥和包容療法治療兒童股骨頭壞死的應(yīng)用價(jià)值。 2.研究方法 研究一:骨髓間質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)和成骨分化的鑒定。 1.分離大鼠骨髓間質(zhì)干細(xì)胞,在37℃、5g/LCO_2、飽和濕度條件下體外培養(yǎng)。培養(yǎng)后的第3天更換培養(yǎng)液以更新細(xì)胞代謝環(huán)境。以后每3 d換液1次,去除未貼壁的細(xì)胞,待細(xì)胞匯合約80%時(shí),用2.5g/L胰蛋白酶(0.4g/L EDTA)消化,按1:2傳代培養(yǎng)。 2.倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)的形態(tài)特性、取生長(zhǎng)良好的2、3代細(xì)胞,2.5g/L胰蛋白酶消化,1×10~4/mL接種于24孔板,每天各取3孔消化計(jì)數(shù),每孔計(jì)數(shù)3次,連續(xù)7d。以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo),細(xì)胞數(shù)為縱坐標(biāo),描繪生長(zhǎng)曲線。 3.用CD34,CD44,CD54抗體免疫法,鈣鈷法,礦化結(jié)節(jié)染色檢測(cè)骨髓間質(zhì)干細(xì)胞成骨作用。 研究二:生脈成骨膠囊對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖作用和成骨分化的實(shí)驗(yàn)研究。 1.制備生脈成骨膠囊含藥血清:給予大鼠生脈成骨膠囊1 g/kg灌胃,于首次灌胃后2 h再次灌胃,末次灌胃1 h后腹主動(dòng)脈采血,離心3000 r/min,20min。收集上清,過濾除菌。用L-DMEM配成含100 g/L含藥血清的培養(yǎng)基。另一組以生理鹽水灌胃、采血、培養(yǎng)基配制,配制成含空白血清的培養(yǎng)基。 2.選擇合適密度的骨髓間質(zhì)干細(xì)胞,給予用血清濃度10%的生脈成骨膠囊血清和空白組(即生理鹽水灌胃)對(duì)骨髓間質(zhì)干細(xì)胞在24孔板中進(jìn)行培養(yǎng),每天各取3孔消化計(jì)數(shù),每孔計(jì)數(shù)3次,連續(xù)7d。以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo),細(xì)胞數(shù)為縱坐標(biāo),描繪生長(zhǎng)曲線。 3.于第7天時(shí)吸取出培養(yǎng)液,用PBS沖洗3次,每次1min,中性福爾馬林室溫固定10min蒸餾水沖洗3次,加入新鮮的孵育液37℃孵育6h,蒸餾水沖洗3次,20g/L硝酸鈷水溶液浸泡5min,蒸餾水沖洗3次,10g/L硫化銨水溶液5min,水洗,中性樹膠固定,標(biāo)記,鏡下觀察。12d時(shí)的吸取出培養(yǎng)液,PBS清洗3次,950g/L乙醇固定30min,PBS清洗3次,1g/L茜素紅染色,雙蒸水沖洗3遍,中性樹膠固定,標(biāo)記,鏡下觀察。 研究三:兒童股骨頭壞死的臨床研究 1.采用臨床回顧性研究為主的方法收集廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院髖中心2004年8月～2007年1月診斷為兒童股骨頭壞死的患兒,進(jìn)行病例隨訪,對(duì)治療方法進(jìn)行分類,有如下三類:未系統(tǒng)治療、髖外展支架治療、補(bǔ)腎活血化瘀中藥生脈成骨膠囊配合髖外展支架治療。用統(tǒng)計(jì)學(xué)的方法分析各組病例的年齡,Catterall分型,骨骺突出指數(shù),VAS疼痛評(píng)分,Stulberg分型,Mose環(huán)標(biāo)準(zhǔn),臨床癥狀,以及各組治療的有效率、優(yōu)良率情況,然后將有效率行×列表的X~2檢驗(yàn)觀察相關(guān)治療方法的結(jié)果評(píng)定。 3.研究結(jié)果 研究一:骨髓間質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)和成骨分化的鑒定。 1.全骨髓培養(yǎng)法可以獲得較好的骨髓間質(zhì)干細(xì)胞,體外培養(yǎng)具有良好的增殖能力,細(xì)胞能在4～7d可完成原代培養(yǎng)。P2代細(xì)胞生長(zhǎng)迅速,以1:3傳代,3天即可鋪滿瓶底。形成均一性良好的單層細(xì)胞,在誘導(dǎo)液誘導(dǎo)下可見成骨分化。 2.實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)MSCs的生長(zhǎng)性狀基本穩(wěn)定,二代細(xì)胞的形態(tài)、生長(zhǎng)曲線無顯著性差異,細(xì)胞為均一的成纖維細(xì)胞樣,潛伏適應(yīng)期在第1～2天(約24h),對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期為第3～5天(約72h),以后進(jìn)入平臺(tái)期,在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,群體倍增時(shí)間34h,傳代周期約6d,每傳代1次細(xì)胞增加約2倍。 3.免疫法結(jié)果顯示在MSCs膜上呈深紅色,不透光為MSCs特性CD44(+)CD54(+),而不表達(dá)造血干細(xì)胞的特性CD34(-)。經(jīng)誘導(dǎo)后的細(xì)胞,堿性磷酸酶染色明顯,胞質(zhì)中陽性反應(yīng)呈現(xiàn)灰黑色顆粒或塊狀沉淀,ALP活性部位呈棕黑色。茜素紅染色可見紅色的礦化結(jié)節(jié)顆粒,顆粒大小不均一,提示有礦化基質(zhì)沉積。 研究二:生脈成骨膠囊對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖作用和成骨分化的實(shí)驗(yàn)研究。 1.采用生脈成骨膠囊血清培養(yǎng)骨髓間質(zhì)干細(xì)胞,細(xì)胞計(jì)數(shù)法測(cè)定和對(duì)照組對(duì)比可見細(xì)胞增殖明顯。 2.經(jīng)中藥血清培養(yǎng)后的細(xì)胞,堿性磷酸酶染色明顯,胞質(zhì)中陽性反應(yīng)呈現(xiàn)灰黑色顆粒或塊狀沉淀,茜素紅染色可見紅色的礦化結(jié)節(jié)顆粒,顆粒大小不均一。 研究三:兒童股骨頭壞死的臨床研究。 在臨床研究中,共有75例78髖納入,其中未系統(tǒng)治療有18髖18例,髖外展支架治療有18例19髖,中藥配合支架治療有39例41髖,經(jīng)過3年隨訪,結(jié)果表明組內(nèi)髖部疼痛VAS評(píng)分有差異(P＜0.05)。股骨頭的外形和骨骺的高度經(jīng)過中藥配合髖外展支架治療恢復(fù)得較好。按Mose環(huán)標(biāo)準(zhǔn),好8髖,可22髖,差11髖。頭臼的匹配情況按照Stulberg分型,三組之間存在差異。整體的療效評(píng)價(jià)用臨床癥狀評(píng)價(jià),三組之間以髖的活動(dòng)度和步態(tài)經(jīng)過比較存在差別,采用生脈成骨膠囊配合髖外展支架治療兒童股骨頭壞死較好,優(yōu)良率為68.3%,有效率82.9%(P＜0.05)。 4.結(jié)論 4.1用全骨髓培養(yǎng)法可以獲得較好的骨髓間質(zhì)干細(xì)胞,具有增殖能力和在誘導(dǎo)下具有定向分化能力。 4.2通過補(bǔ)腎活血化瘀中藥生脈成骨膠囊含藥血清的制備,在體外培養(yǎng)的情況下,和對(duì)照組相比,骨髓間質(zhì)干細(xì)胞增殖明顯,并且有成骨作用,這可能是該中藥在臨床上治療股骨頭壞死的機(jī)理之一。 4.3應(yīng)用中藥生脈成骨膠囊配合髖外展支架治療兒童股骨頭壞死病這一治療方法有較好的療效。
【圖文】：

1.6大鼠骨髓MScs的生長(zhǎng)曲線測(cè)定.取生長(zhǎng)良好的2、3代細(xì)胞，2.59/L胰蛋白酶消化， 1x10弓/mL接種于24孔板，，每天各取3孔消化計(jì)數(shù)，每孔計(jì)數(shù)3次，連續(xù)7d。以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，細(xì)胞數(shù)為縱坐標(biāo)，描繪生長(zhǎng)曲線(圖1)

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