【摘要】： 前言 肺炎支原體(Mycoplasma pneumoniae，Mp)是引起人類呼吸道感染的常見病原體。支原體肺炎常于秋冬季發(fā)病，病人中兒童和青年人居多。本病約占細(xì)菌性肺炎的1／3以上，或占各種原因引起的肺炎的10％，近年來Mp感染有增加的趨勢。支原體肺炎臨床表現(xiàn)常呈非特異性，癥狀輕重不一，其病理形態(tài)可呈多種類型，與其他細(xì)菌或病毒感染引起的肺炎很難區(qū)分。此外，支原體與人體某些組織存在部分共同抗原，感染后可產(chǎn)生相應(yīng)的自身抗體，形成免疫復(fù)合物，導(dǎo)致多系統(tǒng)的免疫損害，可繼發(fā)全身多臟器損害及肺外并發(fā)癥，如心血管癥狀、神經(jīng)癥狀和皮疹出現(xiàn)，有時(shí)甚至危及生命。目前，支原體肺炎診斷的手段雖然很多，但尚無一種特異性和敏感性均較高的方法。本文應(yīng)用培養(yǎng)-增強(qiáng)套式PCR法檢測肺炎患兒的Mp感染，結(jié)合支原體分離培養(yǎng)和雙份血清微量板凝集試驗(yàn)，探討檢測Mp感染的理想方法。 實(shí)驗(yàn)方法 1．標(biāo)本來源 67例肺炎患兒均為2001年3～5月在中國醫(yī)科大學(xué)附屬一院、二院兒科病房住院的患兒。男，39例，女，28例，年齡3個(gè)月～14歲。 2．肺炎支原體的培養(yǎng) 支原體的培養(yǎng)基 支原體基礎(chǔ)培養(yǎng)基，另加20％小牛血清20ml，50％葡萄糖0.4ml，青霉素0.5ml(20萬U／ml)，0.4％酚紅0.5ml，2.5％醋酸鉈0.5ml，調(diào)節(jié)PH至8.0，用于Mp實(shí)驗(yàn)室菌株及臨床標(biāo)本的培養(yǎng)。 肺炎支原體的培養(yǎng)將滅菌棉簽取樣的咽拭子標(biāo)本接種于2 d支原體培養(yǎng)基中，按常規(guī)方法進(jìn)行培養(yǎng)。24h后取出0．4 Inl用 于套式nR，剩余的標(biāo)本繼續(xù)培養(yǎng)。二－ZW后，每天觀察結(jié)果。若 培養(yǎng)基變黃并透明澄清，可轉(zhuǎn)種固體培養(yǎng)基，并做血吸附試驗(yàn)，鑒 定是否為 MP感染；如標(biāo)本培養(yǎng) 21d后，，連續(xù)盲傳 2次，同樣時(shí)間 培養(yǎng)仍無顏色改變的為陰性。 3．標(biāo)本DNA的提取 肺炎支原體標(biāo)準(zhǔn)誅（MP FH）及臨床標(biāo) 本 DNA的提取參照文獻(xiàn)［‘1。操作過程為：取培養(yǎng)物 0．4 Inl在 4t 10000 pm離心 10ndn，棄上清，沉淀用 100gi裂解液懸起（裂解液 的成分為：500mMKCLJ0mM TiS－HCI，PH 8．3 NP40 0．45％， Proteinase k 10m牙Inl）將其置于 50t水浴箱中孵育 Zh，再在 95℃ 加熱15ndn以使裂解液中的蛋白酶K滅活，該溶液即為DNA提 取物。 4．套式PCR擴(kuò)增 依據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的Mp DNA基因序列合成 兩對擴(kuò)增引物，第二對引物為 P；－15’－GCC ACC CTC GGG GGC AGT CAG—3’和 P；－6 5’一 ATC GCA nG CCG TCC TGC GTGG一 3’擴(kuò)增 P；基因的一個(gè) 272堿基對片段。在第二步 PCR過程中，采 用引物 Pl－2 5’－CTG AAC GGG GGC GGG GTG AAGG－3’和 P； 一3 5’一CAG hG GGA ’m’n CCC GCG GAGG—3’擴(kuò)增一個(gè) 133 堿 基對片段，引物由北京賽百勝生物有限公司合成提供。第二次擴(kuò) 增時(shí)被檢測標(biāo)本DNA模板量為10 gi，取擴(kuò)增物2 gi進(jìn)行第2次 擴(kuò)增。PCR反應(yīng)的成分為：4 gi脫氧核耷酸三磷酸混合液，5叫 PCR緩沖液（1X4… MgCI。、p5InM／L）和二…的 Taq多聚酶 門 …入ZPmol引物，最后補(bǔ)充雙蒸去離子水至 50 gi總?cè)萘浚?面加人50gi石蠟油以防PCR循環(huán)過程中產(chǎn)物蒸發(fā)，每次實(shí)驗(yàn)均 設(shè)陰性、陽性和空白對照，兩次反應(yīng)條件一致，均為95℃預(yù)變性 5」n后，再行30個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)為95℃15s，65℃二dn，72℃1． sndn，后延伸階段為 72℃10ndn。取第 2次擴(kuò)增產(chǎn)物 10 gi在二％ ·2· 瓊脂糖凝膠（含 0．5 pgllnl澳化乙錠）上電泳，紫外投射儀上觀察 記錄結(jié)果，與陽性對照有相同條帶的判為陽性。 5．血清學(xué)檢測 采用微量板凝集試驗(yàn)，材料購自日本富士 REBIO公司。實(shí)驗(yàn)方法及結(jié)果判定參照說明書進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)同時(shí)設(shè) 定對照。若單份血清抗體滴度）卜80或第二份血清與第一份血 清相比抗體滴度升高4倍或以上者判為陽性。 6．統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)均經(jīng)X’檢驗(yàn)。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 1．培養(yǎng)－增強(qiáng)套式PCR法（nPCR）和培養(yǎng)法檢測MP的比較 培養(yǎng)法檢出陽性4例，檢出率為6．0％，而培養(yǎng)一增強(qiáng)套式PCR 法檢出陽性 17例，檢出率為 25．4％，二者之間有顯著性差異（X‘ ＝＝二二．52 P＜0．＊二）。 2．培養(yǎng)－增強(qiáng)套式PCR法和微量板凝集試驗(yàn)檢測Mp的比 較nPCR肺炎支原體感染的檢出率為25．4％廠 X雙份血清 檢出率為20．9％O ＊2種檢測方法的檢出率無顯著性差異。 （X‘＝0．39 P＞0．05）。單份血清檢出率為 9．0％（6／67），nPCR 法對肺炎支原體的檢出率明顯高于單份血清微量板凝集試驗(yàn)的檢 出率＊’＝6．35 P＜0．of人以雙份血清抗體滴度呈 4倍增長為診 斷Mp感染的黃金標(biāo)準(zhǔn)，則 nPCR法靈敏度為 85．7％，特異度為 ＊．6％。 3．培養(yǎng)－增強(qiáng)套式PCR產(chǎn)物特異性 采用引物根據(jù)文獻(xiàn)設(shè) 計(jì)合成，特異性較高。本實(shí)驗(yàn)設(shè)陽性和陰性對照，陽性標(biāo)本均出現(xiàn) 預(yù)計(jì)的擴(kuò)增條帶，而陰性標(biāo)本均末出現(xiàn)擴(kuò)增條帶。 4．培養(yǎng)－增強(qiáng)套式PCR產(chǎn)物敏感性 把MP FH標(biāo)準(zhǔn)株接種 于液體培養(yǎng)基中，在37℃溫箱中培養(yǎng)IW，依據(jù)文獻(xiàn)提取＊＊A，分 別取0．6Inl刀．4ml刀．ZInl和0．lrnl的培養(yǎng)液，當(dāng)只
【學(xué)位授予單位】：中國醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2002
【分類號】：R725.6

【參考文獻(xiàn)】

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1 曹玉璞,任桂珍,王秀亭,沈芳,胡宗漢,吳曉音;人肺炎支原體的分離和鑒定[J];中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報(bào);1981年S2期

本文編號：2677512