發(fā)布時(shí)間：2020-05-22 21:24

【摘要】： 目的 先天性肛門直腸畸形(Anorectal Malformations,ARMs)是最常見的消化道畸形。病理改變非常復(fù)雜,且疾病譜廣,表型多種多樣,遺傳方式不清楚,病因及胚胎形成機(jī)制至今未完全闡明。因此,從胚胎學(xué)和分子生物學(xué)探索先天性肛門直腸畸形的發(fā)病機(jī)制和致病基因具有十分重要的意義。近年來,動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)Hoxd-13基因與先天性肛門直腸畸形的發(fā)生有關(guān)。本研究應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色技術(shù)和RT-PCR方法,觀察Hoxd-13在正常和乙烯硫脲(ethylenethiourea,ETU)致畸的肛門直腸畸形大鼠胚胎肛門直腸發(fā)育過程中的表達(dá)情況,旨在探討Hoxd-13基因在先天性肛門直腸畸形發(fā)生機(jī)制中的作用。 材料與方法 一、肛門直腸畸形動(dòng)物模型的建立 應(yīng)用乙烯硫脲致畸制作Wistar大鼠肛門直腸畸形動(dòng)物模型(n=20)。成熟健康Wistar孕鼠妊娠第10天(E10),經(jīng)胃管按125mg/kg體重投以1%ETU,對(duì)照組投以等量的生理鹽水。分別在大鼠妊娠第13天、14天、15天、16天、18天、21天剖宮取胎。一部分標(biāo)本備石蠟切片免疫組化染色之用,另一部分標(biāo)本備RT-PCR之用。 二、Hoxd-13石蠟切片免疫組化染色 大鼠胚胎標(biāo)本經(jīng)4%多聚甲醛固定、脫水后制成蠟塊,行矢狀面連續(xù)切片,連續(xù)動(dòng)態(tài)觀察胎齡13～21天(E13～21)正常及肛門直腸畸形大鼠胚胎肛門直腸的形態(tài)學(xué)變化過程。選正中矢狀面石蠟切片進(jìn)行Hoxd-13免疫組織化學(xué)染色,連續(xù)動(dòng)態(tài)對(duì)比觀察Hoxd-13在正常和肛門直腸畸形大鼠胚胎肛門直腸發(fā)育過程中的表達(dá)情況。 三、Hoxd-13 mRNA RT—PCR 在解剖顯微鏡下應(yīng)用手工顯微切割方法準(zhǔn)確切取泄殖腔/后腸標(biāo)本,提取總RNA,通過RT—PCR方法研究Hoxd-13 mRNA在正常和肛門直腸畸形大鼠胚胎肛門直腸發(fā)育過程中的表達(dá)情況。 結(jié)果 一、連續(xù)石蠟切片觀察形態(tài)學(xué)變化過程 在正常大鼠胚胎發(fā)育過程中,觀察到尿直腸隔進(jìn)行性下降,與泄殖腔膜之間的距離越來越小,直至E15,尿直腸隔與泄殖腔膜融合,使腹側(cè)的尿生殖竇與背側(cè)的后腸完全分離。E16,肛膜破裂,直腸與外界相通。而在肛門直腸畸形大鼠胚胎發(fā)育過程中,與同齡正常大鼠胚胎相比,尿直腸隔發(fā)育較差,與泄殖腔膜之間的距離較大,E15未觀察到二者融合,E16-21觀察到直腸尿道瘺(泄殖腔畸形)的存在。 二、Hoxd-13免疫組織化學(xué)染色結(jié)果 (一)Hoxd-13表達(dá)的部位 正常大鼠胚胎中,Hoxd-13陽性區(qū)域主要分布于尿直腸隔的間質(zhì)以及后腸、泄殖腔膜或肛管/瘺管和尿生殖竇的上皮層。肛門直腸畸形組的大鼠胚胎,陽性區(qū)域主要集中于尿生殖竇上皮層。 (二)Hoxd-13表達(dá)的水平 在兩組大鼠胚胎中,Hoxd-13平均光密度值隨著胎齡的增長(zhǎng)呈總體增加的趨勢(shì),＞E16表現(xiàn)明顯。與對(duì)照組比較,肛門直腸畸形組大鼠胚胎尿直腸隔間質(zhì)、后腸上皮層、泄殖腔膜或肛管(瘺管)上皮層平均光密度值明顯減小,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。E18和E21,比較無明顯差異。Hoxd-13在肛門直腸畸形組各胎齡大鼠胚胎尿生殖竇上皮層平均光密度值較對(duì)照組無明顯差異。 三、Hoxd-13 mRNA RT—PCR半定量檢測(cè)結(jié)果 在正常和肛門直腸畸形大鼠胚胎肛門直腸中均能檢測(cè)出Hoxd-13基因的表達(dá),Hoxd-13mRNA擴(kuò)增條帶在ARMs組呈弱帶或無帶,在對(duì)照組均呈亮帶。其相對(duì)表達(dá)量隨著胎齡的增長(zhǎng)呈總體增加的趨勢(shì),＞E16明顯增強(qiáng)。E13-16,肛門直腸畸形組Hoxd-13基因的表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。E18和E21,兩組比較無明顯差異。RT-PCR結(jié)果與免疫組化結(jié)果一致。 結(jié)論 Hoxd-13在E13-16肛門直腸畸形與正常大鼠胚胎肛門直腸表達(dá)部位的區(qū)別在于:尿直腸隔間質(zhì)以及后腸(直腸)上皮層、泄殖腔膜或肛管(瘺管)上皮層表達(dá)減弱,這種改變可能影響了尿直腸隔與泄殖腔膜的融合,從而導(dǎo)致肛門直腸畸形的發(fā)生。Hoxd-13在大鼠胚胎肛門直腸的差異表達(dá),提示Hoxd-13基因可能與肛門直腸畸形的發(fā)生有關(guān)。
【圖文】：

Hoxd一13在E13大鼠胚胎泄殖腔區(qū)的表達(dá)情況。對(duì)照組:A，B;組:a，b。紅色虛線框所示分別為圖B和圖b的區(qū)域。H:hindgut，后腸;ARMSURS:uroreetalseptum，尿直腸隔;UGS:urogenitalsinus，尿生殖竇;泄殖腔管;CM:cloaealmembrane，泄殖腔膜。(A，a:4OX;CLB，:eloaealeanal，b:400X)
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號(hào)】：R726.5

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前5條

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本文編號(hào)：2676634