【摘要】： 背景與目的 葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥(Gluocose-6-phosphate dehydrogenasedeficiency，簡(jiǎn)稱(chēng)G6PD缺乏癥)[MIM305900]是世界上最常見(jiàn)的單基因遺傳病之一，也是我國(guó)南方地區(qū)人群中常見(jiàn)的血液遺傳病之一，世界范圍內(nèi)約有4億人受累。G6PD缺乏癥屬X連鎖不完全顯性遺傳，男性半合子G6PD活性呈顯著性缺乏，女性雜合子酶活性變化范圍較大，可呈顯著性降低，也可在正常范圍。G6PD基因定位于Xq28，全長(zhǎng)約20kb，含13個(gè)外顯子和12個(gè)內(nèi)含子，編碼515個(gè)氨基酸。G6PD缺乏癥的分子基礎(chǔ)多表現(xiàn)為單個(gè)堿基置換的錯(cuò)義突變，導(dǎo)致氨基酸置換，使G6PD活性降低，還未發(fā)現(xiàn)大片段缺失、無(wú)義突變和移碼突變。目前全世界已報(bào)道了150多種G6PD基因突變型，突變的分布具有種族和地區(qū)異質(zhì)性。迄今為止在東南亞人群中發(fā)現(xiàn)30種G6PD基因突變型，在我國(guó)人群中發(fā)現(xiàn)的突變有24種，其中1388G＞A、1376G＞T、95A＞G是最常見(jiàn)的突變，約占總突變的70％以上。由于方法學(xué)的限制，我國(guó)以往對(duì)該病的研究主要是采取基于男性患者的調(diào)查策略(the male patient-based investigation)，即以表型陽(yáng)性的男性樣本鑒定G6PD缺乏癥的發(fā)生率及其基因突變譜，幾乎未涉及該病的基因型和表型關(guān)系分析。廣西是一個(gè)有著4.9千萬(wàn)人口的少數(shù)民族地區(qū)，該地區(qū)G6PD缺乏癥的流行病學(xué)資料尚不清楚，特別是女性攜帶者和病人的資料幾乎不了解。本研究采用基于人群的分子分析策略(the population-based molecularanalysis)，完成了對(duì)該地區(qū)人群的G6PD缺乏癥發(fā)生率、突變譜、表型與基因型關(guān)系和單倍型的分析，以及女性的系統(tǒng)分子鑒定。 設(shè)計(jì)與方法 用于本研究的樣本共4，704例(其中男性2，368例，平均年齡29.45±5.06歲；女性2，336例，平均年齡26.52±3.89歲)，于2002年10月至2003年10月期間于柳州市婦幼保健院婚檢門(mén)診采集，被檢者就診時(shí)均無(wú)貧血表現(xiàn)。這些樣品98.5％是來(lái)自于中國(guó)南方地區(qū)，其中94.8％的樣本的祖籍地來(lái)自廣西壯族自治區(qū)14個(gè)不同地區(qū)，無(wú)血緣關(guān)系。隨機(jī)選取的樣本中漢族和壯族人群的比例與廣西全區(qū)二者的比重相同，分別占64.3％(3，027／4，704，漢族)和32.5％(1，528／4，704，壯族)，其余149例樣品來(lái)自其他少數(shù)民族。正常對(duì)照129例，其中男性64例，年齡：23～42，平均年齡29.91±3.29，G6PD／6PGD比值為：1.62～1.79(1.73±0.11)；女性65例，年齡：23～34，平均年齡27.48±2.56，G6PD／6PGD比值為：1.58～1.93(1.65±0.09)。本研究提出并建立了表型篩查與基因型分析結(jié)合的系統(tǒng)分子鑒定流程：采用傳統(tǒng)的高鐵血紅蛋白還原試驗(yàn)(methemoglobin reduction test，MetRT，檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)為：MetHb％＞75％為陰性；MetHb％≤75％，為陽(yáng)性)進(jìn)行初篩，然后用WHO推薦的G6PD／6PGD比值法(診斷標(biāo)準(zhǔn)為：比值＞1.5為陰性；比值≤1.5為陽(yáng)性)進(jìn)行檢測(cè)，接著我們把所有經(jīng)過(guò)檢測(cè)高鐵血紅蛋白還原試驗(yàn)為陽(yáng)性的樣品(或者說(shuō)經(jīng)過(guò)G6PD／6PGD比值法確診為表型陽(yáng)性的樣品和所有疑似樣品)用標(biāo)準(zhǔn)方法抽提基因組DNA，通過(guò)引物延伸／變性高效液相色譜(primer extension／Denaturing High Performance Liquid Chromatographty，PE／DHPLC)技術(shù)進(jìn)行基因型分析，該技術(shù)能同時(shí)檢測(cè)10種東南亞地區(qū)常見(jiàn)G6PD基因突變型(95 A＞G 392 G＞T，487 G＞A，493 A＞G，592 C＞T，871 G＞A，1024C＞T，1360 C＜T，1376 G＞T和1388 G＞A)和一種多態(tài)性位點(diǎn)(1311 C＞T)，最后，為了檢測(cè)是否存在新突變或其他突變類(lèi)型，我們對(duì)PE／DHPLC技術(shù)未檢測(cè)出的陰性樣本進(jìn)行G6PD基因12個(gè)外顯子和外顯子-內(nèi)含子結(jié)合區(qū)的直接測(cè)序。此外，我們從高鐵血紅蛋白還原試驗(yàn)檢測(cè)為陰性的4，263例樣品中隨機(jī)選取129例樣品作為正常對(duì)照組，用PE／DHPLC技術(shù)檢測(cè)其G6PD基因突變的情況，在65例女性樣品中發(fā)現(xiàn)兩例常見(jiàn)突變類(lèi)型(1376 G＞T和1388 G＞A)，為了驗(yàn)證這部分女性樣品是否還存在其他G6PD基因突變類(lèi)型，我們同時(shí)對(duì)其進(jìn)行DNA測(cè)序。本研究診斷G6PD缺乏癥的標(biāo)準(zhǔn)主要包括：(1)高鐵血紅蛋白還原試驗(yàn)(MetRT)和G6PD／6PGD比值法檢測(cè)為表型陽(yáng)性；或者(2)用PE／DHPLC技術(shù)或DNA測(cè)序進(jìn)行分子學(xué)分析檢測(cè)出陽(yáng)性突變。 結(jié)果與討論 本研究共檢測(cè)出G6PD缺乏癥陽(yáng)性樣品361例，其中男性個(gè)體176例，因此廣西壯族自治區(qū)G6PD缺乏癥基因頻率為7.43％；女性個(gè)體185例，該地區(qū)漢族人群的突變基因頻率(16.38％，249／1，520)與壯族人群(15.39％，117／760)比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(X~2=2.368，P＞0.05)。我們從上述361例樣品中鑒定出320例個(gè)體有陽(yáng)性基因突變，共27種不同基因型，包括8種半合子、13種雜合子和6種純合子，此外，還有41例(15例男性和26例女性)表型陽(yáng)性的樣品未發(fā)現(xiàn)任何突變。我們對(duì)G6PD基因突變譜鑒定結(jié)果顯示，1388G＞A(G6PD Kaiping)，1376G＞T (G6PD Canton)，95A＞G (G6PD Gaohe)，1024C＞T (Chinese-5)和871G＞A (G6PD Viangchan)等5種突變?yōu)樵摰貐^(qū)人群的常見(jiàn)突變，占G6PD缺陷等位基因的85％，另外檢測(cè)到10種(392G＞T，442G＞A，1004C＞T，202G＞A，592C＞T，519C＞T，196T＞A，703C＞T，202G＞A／871G＞A和1414A＞C)少見(jiàn)突變，約占突變?nèi)旧w的4％。在這些變異中，有6種為中國(guó)人首次報(bào)道的突變，其中4種為我們研究發(fā)現(xiàn)的新突變，它們是442G＞A (G6PD Liuzhou)，703C＞T(G6PD Nanning)，1414A＞C (G6PD Laibin)，202G＞A／871G＞A(G6PD Hechi)；另二種稀有突變，196T＞A和202G＞A曾分別在泰國(guó)和日本人中報(bào)告過(guò)。此外，我們根據(jù)G6PD／6PGD比值表型指標(biāo)的變化，將女性三種常見(jiàn)突變(分別為1376G＞T，1388G＞A，95A＞G)雜合子的相同基因型樣品進(jìn)一步分為陽(yáng)性組(G6PD／6PGD≤1.5)和陰性組(G6PD／6PGD＞1.5)，兩兩比較這3種相同基因型各自配對(duì)的陽(yáng)性組與陰性組之間的表型差異，結(jié)果顯示MetHb％和G6PD／6PGD比值在三配對(duì)資料二組之間均有顯著差異(P=0.000，P＜0.05，本研究提示，即使是在相同突變時(shí)，女性雜合子的G6PD酶活性存在很大的變異性，由于G6PD缺乏癥的遺傳方式呈X連鎖不完全顯性遺傳，根據(jù)Lyon學(xué)說(shuō)，女性的兩個(gè)G6PD等位基因，有一個(gè)處于失活狀態(tài)，即隨著酶缺乏的紅細(xì)胞與正常的紅細(xì)胞嵌合的差異，女性雜合子具有不同的表現(xiàn)度，這與該病不完全顯性的遺傳方式相吻合。分組比較的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果顯示，表型指標(biāo)高鐵血紅蛋白還原率(MetHb％)和G6PD／6PGD比值在女性雜合子組(MetHb％：43.22±17.42；G6PD／6PGD：1.33±0.40；n=164)和男性半合子(MetHb％：29.63±15.12；G6PD／6PGD：0.50±0.31；n=176)有顯著差異(P=0.000，P＜0.05；女性雜合子組(同上)和純合子組(MetHb％：33.16±6.34；G6PD／6PGD：0.57±0.24；n=21)有顯著差異(P=0.000，P＜0.05；而男性半合子組和女性純合子組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(MetHb％：P=0.272，P＞0.05；G6PD／6PGD：P=0.310，P＞0.05)；正常對(duì)照組(正常參考值為MetHb％：88.10±5.23；G6PD／6PGD：1.70±0.11；n=129，男性64例，女性65例，無(wú)性別差異，P=0.121，P＞0.05)與上述雜合子、純合子和半合子各組間均有差異(P=0.000，P＜0.05。同時(shí)從129例表型“正�！睒悠分薪�(jīng)過(guò)測(cè)序檢測(cè)出3例突變(1376G＞T，1388G＞A和1414A＞C)，這提示了包括常見(jiàn)變異在內(nèi)的許多隱性突變體很可能隱藏在“正�！半s合子個(gè)體中，而被一般表型篩查所漏檢，只有采用直接分子篩查才可以鑒定這類(lèi)突變。我們對(duì)176例男性G6PD缺陷染色體和6例女性新突變?nèi)旧w的單倍型進(jìn)行了202A(NlaⅢ)，376G(FokⅠ)，1116G(Pst)，1311T(BclⅠ)，內(nèi)含子11-93C(NlaⅢ)等5個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)的分析，結(jié)果表明182個(gè)缺陷染色體中的94％為單倍型(--+--)，提示常見(jiàn)的nt95A＞G，1024C＞T，1376G＞T和1388G＞A等4個(gè)位點(diǎn)的突變應(yīng)源于這一古老的常見(jiàn)單倍型，，此外，還存在三種不同的單倍型：8例G6PD Viangchan突變、1例G6PD Canton突變和6例未知突變?yōu)閱伪缎?--+++)；新突變G6PD Hechi~(202A／871A)為單倍型(+-+-+)和G6PD Asali為單倍型(+-+--)。我們發(fā)現(xiàn)這5個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)之一的常見(jiàn)1311T在當(dāng)?shù)啬行灾械念l率為7.8％，該多態(tài)性基因頻率與1311T／內(nèi)含子11-93C cis變異的頻率相同，內(nèi)含子11.93C產(chǎn)生的NlaⅢ限制性酶切位點(diǎn)與1311C＞T呈現(xiàn)緊密關(guān)聯(lián)，可能導(dǎo)致G6PD hnRNA(heterogeneous nuclear RNA)在形成成熟的Mrna過(guò)程中，核內(nèi)的snRNA與內(nèi)含子11的結(jié)合引起構(gòu)像改變，從而引起酶活性的缺乏；同時(shí)我們?cè)趶V西地區(qū)檢測(cè)到的11例871G＞A突變均合并1311多態(tài)性位點(diǎn)，形成的單體型均屬于G6PD Viangchan變異型，這與目前東南亞包括中國(guó)南方地區(qū)所有的報(bào)道相一致。 綜上所述，我們的流行病學(xué)調(diào)查不僅闡明了廣西壯族自治區(qū)人群G6PD缺乏癥的發(fā)生率、基因突變譜、單倍型和一組基因型和表性關(guān)系的分析結(jié)果，而且詳細(xì)地描述了女性攜帶者和病人的情況，這為制訂該地區(qū)G6PD缺乏癥的預(yù)防計(jì)劃提供有價(jià)值的參考，同時(shí)對(duì)于闡明G6PD基因分布和遺傳規(guī)律，揭示地區(qū)人群起源和遷徙有重要作用。G6PD缺乏癥的快速診斷除了能提供遺傳咨詢(xún)信息，預(yù)防溶血性貧血、新生兒高膽紅素血癥和孕婦流產(chǎn)外，還為臨床鑒別診斷和病因研究提供有利的支持。本研究所采用的表型篩查與基因型分析結(jié)合的系統(tǒng)分子鑒定流程，除了可應(yīng)用于廣西地區(qū)對(duì)G6PD缺乏癥進(jìn)行調(diào)查外，還可以用于世界上G6PD缺乏癥高發(fā)的不同地區(qū)進(jìn)行該病的調(diào)查，對(duì)擴(kuò)展G6PD基因缺陷的相關(guān)知識(shí)提供重要的依據(jù)。
【圖文】：

-介咬-.今礴~Fr.，.們時(shí)之Fro.口..t3圖2一3多重PCR擴(kuò)增片段及n個(gè)常見(jiàn)突變位點(diǎn)示意圖FigZ一 3SehematiediagramsofmultiPlexPCRandmultiPlexPE/DHPLCfordeteetionof elevenmutationsinG6PDgene. TheorangeboxeseorreSP0ndtothe13exonsoftheG6pDgene， withtheintronsdenotedbythiek 1ineorbrokenline.TheboldarrowsindieatethelocationsanddireetionsforthreePairsofPri一ners usedfor一 nultiPlexPCR.ThedownwardvertieallinesmarkthePositionsforeachofeleven一nostfreqt一 entSoutlleastAsia一 nutationstestedi一 1thisassay.Theightarrows(fromAtoK)indicatethe loeationsanddireetionsforthePrimersLlsedinPEI(grouPI)andthatthePrimersC，D， F.qand HwereassembledatPEZ(grouPZ).TheelusteredPEProduetsforeaehgrouPcanbeseParated underfully刁e一 laturingcollditionsonDHPLCanalyze爪 dePendedonbothsizeandsequeneeof 0ligonueleotidestested.(GrantWu.Wei一 HuaLia一19.Ji一 nZhu， elal.RaPidandSimultaneous

S‘T.nl.《M.nu.二〕圖2一2引物延伸終止反應(yīng)基因分型DHPLC分離示意圖Fig.2一 2SehematiediagramshowingthePrineiPleofgenemutationbyPrimerextension/DHPLC.Primer:CATCAGGAGTGGACAGATCTCCAAAGGACT;Normal:CATCAGGAGTGGACAGAI，CTCCAAAGGACTC;Mutant:CATCAGGAGTGGACAGATCTCCAAAGGACI，A6， 8gl01112Ex.l一13二尸.鉀蒸一”r『沖防軍鉀.﨑 4..咭 J..... .211‘丫L|HI 01..川111 GIGI..E引.-伽·一心-Fr艦m二l-介咬-.今礴~Fr.，.們時(shí)之Fro.口..t3圖2一3多重PCR擴(kuò)增片段及n個(gè)常見(jiàn)突變位點(diǎn)示意圖FigZ一 3SehematiediagramsofmultiPlexPCRandmultiPlexPE/DHPLCfordeteetionof elevenmutationsinG6PDgene. TheorangeboxeseorreSP0ndtothe13exonsoftheG6pDgene， withtheintronsdenotedbythiek 1ineorbrokenline.TheboldarrowsindieatethelocationsanddireetionsforthreePairsofPri一ners usedfor一 nultiPlexPCR.ThedownwardvertieallinesmarkthePositionsforeachofeleven一nostfreqt一 entSoutlleastAsia一 nutationstestedi一 1thisassay.Theightarrows(fromAtoK)indicatethe loeationsanddireetionsforthePrimersLlsedinPEI(grouPI)andthatthePrimersC，D， F.qand HwereassembledatPEZ(grouPZ).TheelusteredPEProduetsforeaehgrouPcanbeseParated underfully刁e一 laturingcollditionsonDHPLCanalyze爪 dePendedonbothsizeandsequeneeof 0ligonueleotidestested.(GrantWu.Wei一 HuaLia一19.Ji一 nZhu
【學(xué)位授予單位】：第一軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類(lèi)號(hào)】：R725.8

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2673352