【摘要】：目的:生發(fā)基質(zhì)-腦室內(nèi)出血(Germinal matrix-intraventricular hemorrhage,GM-IVH)通常由于早產(chǎn)兒自身生發(fā)基質(zhì)脈管系統(tǒng)的脆弱特點(diǎn),再加上血流動(dòng)力學(xué)及呼吸不穩(wěn)定等原因,容易造成不成熟血管破裂出血,是早產(chǎn)兒最常見的并發(fā)癥之一。出血后的血腫壓迫了周圍腦白質(zhì),引發(fā)顱高壓、離子超載、氧自由基增多,產(chǎn)生一系列如炎癥、脫髓鞘,細(xì)胞凋亡等病理改變,可使患兒遺留不同程度的神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥,造成家庭及社會(huì)沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)與心理壓力。研究發(fā)現(xiàn),早產(chǎn)兒腦白質(zhì)受損后可見大量透明質(zhì)酸(Hyaluronic acid,HA)聚集。在研究脫髓鞘損傷的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn):HA可以阻礙少突膠質(zhì)前體細(xì)胞(Oligodendrocyte precursor cells,OPCs)發(fā)育成熟和腦白質(zhì)髓鞘形成。目前已知,GM-IVH可誘導(dǎo)腦室周圍白質(zhì)產(chǎn)生炎癥反應(yīng)和HA聚集,我們推測(cè)HA也可能參與GM-IVH后OPCs發(fā)育受阻,阻礙腦白質(zhì)髓鞘形成。透明質(zhì)酸酶(Hyaluronidase,HAase)可以分解HA,對(duì)發(fā)生GM-IVH的早產(chǎn)兒,應(yīng)用腦內(nèi)注射HAase降解HA,能否達(dá)到減輕HA對(duì)腦組織OPCs發(fā)育的阻礙作用,繼而減輕患者腦白質(zhì)髓鞘形成障礙?關(guān)于這方面的研究國(guó)內(nèi)外少有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過早產(chǎn)兔獲取GM-IVH動(dòng)物模型,給予GM-IVH的動(dòng)物腦內(nèi)注射HAase,作為HAase治療組,并設(shè)置對(duì)照組,即模型組。觀測(cè)兩個(gè)不同指標(biāo):(1)神經(jīng)膠質(zhì)抗原2(Neuron-glial antigen2,NG2),該指標(biāo)反應(yīng)OPCs的發(fā)育成熟情況;(2)髓鞘堿性蛋白(Myelin basic protein,MBP):反應(yīng)CNS髓鞘脫失的特異性指標(biāo)。該實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖怯^察HAase治療能否改善GM-IVH早產(chǎn)兔腦組織OPC發(fā)育受阻,減輕腦室周圍腦白質(zhì)的髓鞘脫失,達(dá)到神經(jīng)保護(hù)作用,為臨床治療早產(chǎn)兒GM-IVH提供新思路。方法:1.制備早產(chǎn)兔GM-IVH動(dòng)物模型:新西蘭兔的正常懷孕時(shí)間為32天,選擇健康孕29天的新西蘭大白兔剖宮產(chǎn),出生的兔子為早產(chǎn)兔。實(shí)驗(yàn)共用早產(chǎn)兔80只,體重在30~55g之間,生后給予暖箱保溫、早產(chǎn)兒奶粉喂養(yǎng),將獲取的早產(chǎn)兔隨機(jī)分成正常組、模型組(單純GM-IVH模型)、治療組(GM-IVH模型+HAase治療)三個(gè)組別。在生后3小時(shí)內(nèi),出血組(即模型組和治療組)的早產(chǎn)兔接受50%的丙三醇注射,注射方式為腹腔注射,劑量為10ml/Kg,目的為誘導(dǎo)早產(chǎn)兔發(fā)生GM-IVH。正常組不給予任何處理。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)操作流程均遵循國(guó)際動(dòng)物委員會(huì)制訂的倫理道德規(guī)范執(zhí)行。2.出血的確立及治療:(1)1天后所有早產(chǎn)兔接受頭顱超聲檢查,驗(yàn)證早產(chǎn)兔顱內(nèi)出血的發(fā)生請(qǐng)況。(2)治療組早產(chǎn)兔側(cè)腦室注射HAase:在超聲指引下,在生后第2天、4天和第6天,治療組早產(chǎn)兔接受經(jīng)前囟側(cè)腦室注射HAase,劑量為20ul/kg。(3)模型組按上述方法向側(cè)腦室注射同等劑量的生理鹽水,正常組不給予任何處理。3.提取腦組織:將正常組、模型組、HAase治療組三組早產(chǎn)兔分別在生后第3天、7天、14天隨機(jī)處死,迅速取出腦組織,獲得的腦組織一部分放入-80℃冰箱中保存,供蛋白印跡實(shí)驗(yàn)使用。其余腦組織置于4%多聚甲醛中固定,進(jìn)行免疫組化染色和蘇木精-伊紅染色。4.應(yīng)用免疫組化法觀察三組標(biāo)本中不同時(shí)間點(diǎn)NG2的表達(dá)情況。5.應(yīng)用蛋白印跡實(shí)驗(yàn)對(duì)比三組標(biāo)本中不同時(shí)間點(diǎn)MBP的表達(dá)情況。6.數(shù)據(jù)分析:應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件、Microsoft Excel 2003軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理,數(shù)據(jù)符合計(jì)量資料時(shí)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,組間比較采用LSD檢驗(yàn);若數(shù)據(jù)不滿足方差齊性檢驗(yàn)則采用秩和檢驗(yàn)(rank-sum test)的方法。檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)設(shè)為0.05,P值0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果:1成功復(fù)制GM-IVH動(dòng)物模型顱腦超聲檢查結(jié)果:模型組30只,未出血有5只,實(shí)驗(yàn)期間死亡4只,實(shí)際參與實(shí)驗(yàn)有21只;治療組29只,未出血3只,實(shí)驗(yàn)期間死亡5只,實(shí)際參與實(shí)驗(yàn)有21只;正常組21只均未出血,實(shí)驗(yàn)期間未發(fā)生死亡,實(shí)際參與實(shí)驗(yàn)有21只。腦組織HE染色結(jié)果:誘導(dǎo)GM-IVH成功的早產(chǎn)兔,在光學(xué)顯微鏡下觀察腦組織可見:腦室周圍大量紅細(xì)胞及炎性細(xì)胞浸潤(rùn),未出血組無明顯變化,證實(shí)早產(chǎn)兔GM-IVH模型制備成功。2早產(chǎn)兔腦組織NG2表達(dá)本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)各組早產(chǎn)兔在腦室周圍腦白質(zhì)區(qū)均可見NG2細(xì)胞表達(dá)。隨著時(shí)間推移,正常組早產(chǎn)兔腦組織中NG2表達(dá)量逐漸降低,三個(gè)時(shí)間點(diǎn)兩兩比較,在生后3天與生后7天、生后14天比較,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),生后7天與生后14天比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);模型組和HAase治療組的早產(chǎn)兔腦組織中NG2表達(dá)量逐漸降低,三個(gè)時(shí)間點(diǎn)兩兩比較,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);同一時(shí)間點(diǎn)比較,在生后3天與生后14天,NG2細(xì)胞表達(dá)量:HAase治療組正常組模型組,生后7天NG2細(xì)胞表達(dá)量略有不同,由大到小依次排序?yàn)镠Aase治療組模型組正常組,無論在生后3天、7天還是14天,任何一個(gè)時(shí)間段三組兩兩比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。3早產(chǎn)兔腦組織MBP表達(dá)各組新生早產(chǎn)兔在腦出血周圍腦白質(zhì)區(qū)均可見MBP陽性表達(dá)。三組早產(chǎn)兔MBP蛋白的表達(dá)量隨著日齡的增加而增加,方差分析具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。正常組和HAase治療組MBP的的表達(dá)量在生后3天、7天、14天三個(gè)時(shí)間點(diǎn)兩兩比較,差異具有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);在生后14天時(shí),HAase治療組MBP的的表達(dá)量高于正常組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。模型組早產(chǎn)兔MBP的表達(dá)量在生后14天與生后3天、7天比較,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),但生后3天與生后7天比較,兩組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。在同一時(shí)間點(diǎn),MBP的的表達(dá)量為HAase治療組模型組,方差分析有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論:早產(chǎn)兔GM-IVH后,腦組織中NG2、MBP表達(dá)量降低,提示GM-IVH阻礙OPCs發(fā)育和腦白質(zhì)髓鞘形成;經(jīng)側(cè)腦室給予注射透明質(zhì)酸酶后,HAase治療組NG2、MBP表達(dá)量高于模型組,提示經(jīng)透明質(zhì)酸酶治療后有利于少突膠質(zhì)前體細(xì)胞發(fā)育和髓鞘形成。
【學(xué)位授予單位】：承德醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R722.6

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本文編號(hào)：2673317