【摘要】： 目的 新生兒缺氧缺血性腦病(HIE)可致新生兒死亡或永久性的神經(jīng)系統(tǒng)損傷，現(xiàn)已證明，新生大鼠缺氧缺血性腦損傷(HIBD)后存在神經(jīng)細(xì)胞凋亡，主要位于實(shí)驗(yàn)側(cè)皮層、海馬、丘腦及紋狀體。Caspase家族，是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的一類天冬氨酸特異酶切的半胱氨酸蛋白酶，哺乳類啟今已發(fā)現(xiàn)至少14種Caspases參與細(xì)胞凋亡。Capase-3是細(xì)胞凋亡過(guò)程中最主要的終末剪切酶，一旦被激活，凋亡常難以避免，因此Caspase-3是有可能被阻抑的最下游凋亡執(zhí)行蛋白，該酶是否被激活也是鑒別細(xì)胞凋亡與壞死的主要依據(jù)。Caspase-3與ced-3高度同源，是細(xì)胞在執(zhí)行PCD過(guò)程中的關(guān)鍵步驟。已證明，大腦缺血后表達(dá)、裂解并活化了Caspase-3。大量研究已證明，新生大鼠HIBD后Caspase-3活化參與了神經(jīng)細(xì)胞凋亡。HI后連續(xù)表達(dá)活化的Caspase-3和凋亡性形態(tài)的細(xì)胞持續(xù)存在達(dá)數(shù)天提示在新生兒缺氧缺血性腦損傷中凋亡持續(xù)存在。Bel-xL是Bel-2家族成員之一，具有抗凋亡作用，Bel-xL表達(dá)增加可阻止Caspase-3活化，從而阻止凋亡的級(jí)聯(lián)反應(yīng)。 本文研究新生大鼠缺氧缺血性腦損傷神經(jīng)細(xì)胞凋亡持續(xù)時(shí)程，新生大鼠HIBD晚期Caspase-3、Bel-xL基因及其蛋白表達(dá)情況，以及堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)對(duì)HIBD晚期神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響。方法 選用本院動(dòng)物室提供的健康新生7日齡Wistar大鼠為研究對(duì)象，用Rice法制成HIBD模型。缺氧濃度為8±1％，艙溫36±1℃，缺氧持續(xù)1.5 小時(shí)。本實(shí)驗(yàn)采用此模型進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)。在缺氧缺血(HI)后不同時(shí)間處 死取腦進(jìn)行研究，并設(shè)同批正常組及假手術(shù)組作對(duì)照，研究?jī)?nèi)容如下:1.應(yīng) 用蘇木素一伊紅(HE)染色、透射電鏡、流式細(xì)胞檢測(cè)術(shù)(FcM)及末端脫氧 核昔酸轉(zhuǎn)移酶(TdT)介導(dǎo)的生物素化一dUTP原位缺口末端標(biāo)記(TUNEL) 研究新生大鼠扭BD晚期神經(jīng)細(xì)胞凋亡持續(xù)時(shí)程。2.應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈 式反應(yīng)(RT一PcR)及免疫組織化學(xué)方法研究與凋亡有關(guān)的基因CasPase一 3、Bd一xL的mRNA及其蛋白在新生大鼠Hl后晚期在腦中表達(dá)的情況。 RT一PcR:反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈(RT)，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，用CIS- 700D凝膠掃描成像分析系統(tǒng)掃描各擴(kuò)增產(chǎn)物，Casapse一3mRNA及Bd- xLmRNA表達(dá)水平以GApDH的相對(duì)表達(dá)量即Caspase一3/自廿DH及Bcl- xL/GAPDH計(jì)算，數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)。免疫組織化學(xué)方法:標(biāo)本為腦組織石蠟 切片，預(yù)先經(jīng)電爐加熱抗原修復(fù)，進(jìn)行SABC染色。結(jié)果判定:400倍光鏡 下觀察每組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)各5只大鼠腦組織切片(各二張)，經(jīng)數(shù)碼相機(jī)采 樣，左右皮層及海馬各5個(gè)視野，輸人Meta Mp印h Imager勿stem versiou4.6， 將大腦皮層的免疫陽(yáng)性細(xì)胞的染色強(qiáng)度變成量化指標(biāo)，計(jì)算其平均光密度 (OD)值，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。3.觀察堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子對(duì)新生 大鼠HIBD持續(xù)保護(hù)機(jī)制以及在新生大鼠HIBD晚期不同bFGF治療方案 對(duì)CasPase一3和Bd一xL蛋白表達(dá)、DNA斷裂的影響。首先制備新生大鼠 HIBD模型，隨機(jī)分成6組:bFGFI組(HI后腹腔注射bFGF 4u·g一’，連用3 周)、bFGn組(HI后腹腔注射bFGF 4u·g一’，第一及第三周用)、bFG玲 組(111后腹腔注射bFGF 4u·g一’，僅第一周用)及相應(yīng)治療方案的生理鹽 水對(duì)照組即對(duì)照1組、對(duì)照2組、對(duì)照3組，各組大鼠均于HI后3周處死， 每組各5只。比較TUNEL染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)及免疫組化方法觀察CasPase- 3、Bcl一xL蛋白表達(dá)情況。 結(jié)果 1 .HE染色:HIBD動(dòng)物模型組，在班后2周、3周、4周時(shí)左側(cè)大腦后 扣帶皮層區(qū)神經(jīng)細(xì)胞明顯少于右側(cè)，額頂皮層運(yùn)動(dòng)區(qū)及額頂皮層軀體感覺(jué)、 區(qū)均可見(jiàn)神經(jīng)細(xì)胞明顯減少，皮層以111一W層細(xì)胞減少較I一n層明顯，代 之以較多的星形膠質(zhì)細(xì)胞;在HI后3周時(shí)即可見(jiàn)腦組織形成界限清楚的壞 死灶，壞死灶中可見(jiàn)較多的少突膠質(zhì)細(xì)胞及小膠質(zhì)細(xì)胞，半暗帶內(nèi)可見(jiàn)細(xì)胞 呈三種變性形態(tài):①細(xì)胞皺縮、核濃縮;②胞漿內(nèi)核碎片;③單個(gè)圓形凋亡小 體。有者在左側(cè)丘腦處亦可見(jiàn)壞死灶。右側(cè)扣帶區(qū)皮質(zhì)常為散在神經(jīng)元丟 失、神經(jīng)元排列紊亂等改變，正常組及假手術(shù)組均未見(jiàn)到明顯的病變。 2.TUNEL染色結(jié)果:發(fā)現(xiàn)Hl后2周、3周和4周時(shí)在額頂皮層軀體感 覺(jué)區(qū)、紋狀體、丘腦及海馬處有一些散在的染色質(zhì)濃縮呈黃色顆粒的圓形或 卵圓形的凋亡細(xì)胞，以額頂皮層軀體感覺(jué)區(qū)相對(duì)多見(jiàn)，在半暗帶內(nèi)亦可見(jiàn)凋 亡細(xì)胞，皮層以111一W層凋亡細(xì)胞較I一n層多。正常對(duì)照組全腦于各時(shí) 間點(diǎn)，10個(gè)高倍視野凋亡細(xì)胞數(shù)為O一6個(gè)(4.20土1 .30)，，可見(jiàn)大鼠于出生 后，在生理情況下大腦神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生極少量的凋亡，假手術(shù)組及右側(cè)腦亦有 同樣的規(guī)律。HI后3周時(shí)左腦凋亡細(xì)胞數(shù)為8.00土1.00，與正常組(4.20 土1 .30)比較，差異有顯著性(t=5.17，P0.01);在Hl后4周時(shí)左腦凋亡 細(xì)胞數(shù)(4.00土1.00)與對(duì)照組比較差異無(wú)顯著性(t=0.27，P0.05)。 3.局灶性腦缺血后腦組織DNA斷裂百分率的變化:HI后3周時(shí)腦組 織DNA斷裂百分率為8 .19土2.49，與正常組(3.04土0.12)比較，DNA斷裂 百分率之間差異有顯著性(t二4.62，P0.05)，而HI后4周時(shí)則差異無(wú)顯 著性(t=0.27，P0.05)。 4.透射電鏡發(fā)現(xiàn):HI后3周時(shí)，仍可見(jiàn)到凋亡細(xì)胞，表現(xiàn)為染色質(zhì)邊 集、聚集成塊
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2003
【分類號(hào)】：R722.1

【參考文獻(xiàn)】

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1 楊琴,胡常林;堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子對(duì)腦缺血后神經(jīng)元特異性烯醇化酶的影響[J];臨床神經(jīng)病學(xué)雜志;1998年04期

2 吳明遠(yuǎn)!310006杭州,石一復(fù)!310006杭州;缺氧、缺血對(duì)新生鼠大腦半胱氨酸蛋白酶活性的影響[J];中華婦產(chǎn)科雜志;2001年02期

本文編號(hào)：2666633