【摘要】： 低氧血癥是危重新生兒常見的臨床表現(xiàn),嚴(yán)重時可危及生命。氧療是改善新生兒缺氧狀態(tài)的重要治療方法,在新生兒特別是早產(chǎn)兒,由于肺發(fā)育不成熟,肺間質(zhì)和肺泡分化不全,肺彈力纖維和結(jié)締組織發(fā)育不良,未成熟肺長時間暴露于高氧下會導(dǎo)致肺上皮細(xì)胞損傷、死亡、急性肺損傷(Acute lung injury, ALI)甚至呼吸功能衰竭致支氣管肺發(fā)育不良( bronchopulmonary dysplasion ,BPD)。近年來BPD在全球發(fā)病率逐年增高,存活者常伴有明顯肺發(fā)育障礙和功能低下,目前國際上尚無確定有效的防治方法,但大量臨床資料顯示高濃度吸氧、長時間氧療是導(dǎo)致BPD的高危因素,其病因與高氧性肺損傷密切相關(guān)。當(dāng)前國內(nèi)外研究主要集中在如下幾個方面①嘗試用肺表面活性物質(zhì)蛋白(SP-A)彌補(bǔ)損傷的AECⅡ功能,但SP-A生物提成困難,遠(yuǎn)期效果不盡理想,②也有學(xué)者企圖通過上皮干細(xì)胞定向分化為AECⅡ再移植給肺損傷的病人,但未解決細(xì)胞分化、培養(yǎng)、體內(nèi)生長調(diào)控等問題,③利用基因工程技術(shù)所生產(chǎn)的生長因子藥物如表皮生長因子(EGF),堿性成纖維細(xì)胞因子(bFGF),神經(jīng)生長因子(NGF)雖較好地應(yīng)用于體表創(chuàng)燒傷患者的修復(fù)重建,但目前尚不能在肺損傷的主動修復(fù)重建中應(yīng)用。④雖發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-β)和干擾素(INF-γ)在肌成纖微細(xì)胞的轉(zhuǎn)型異常中分別起正負(fù)調(diào)控作用,但兩者相互拮抗的機(jī)制并不清楚。⑤雖發(fā)現(xiàn)細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的積聚在肺纖維化發(fā)展過程中的作用,然而目前尚無有效方法阻止ECM的積聚⑥由于肺損傷后AECⅡ修復(fù)重建的一系列病理生理變化仍不清,因而現(xiàn)今臨床上采用的多種治療方法如:更換機(jī)械通氣模式、激素、表面活性物質(zhì)替代療法、免疫療法等均收效甚微�；仡櫼酝难芯慷嗉性谌绾巫钄嘤泻σ蛩貙ECⅡ的損害,而對損傷后如何保護(hù)和促進(jìn)AECⅡ修復(fù)重建研究甚少,近年的研究發(fā)現(xiàn),肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞(Alveolar epithelial typeⅡcells,AECⅡ)存活和凋亡變化可能參與高氧肺損傷的發(fā)展和轉(zhuǎn)歸,影響肺損傷修復(fù)的結(jié)局。如果早期干預(yù)AECⅡ的凋亡變化就可能減輕肺上皮細(xì)胞損傷,從而逆轉(zhuǎn)肺損傷,并阻斷后續(xù)的肺間質(zhì)增生和肺組織纖維化。AECⅡ的主動修復(fù)理論是近年來研究的熱點(diǎn),尋找促進(jìn)AECⅡ主動修復(fù)的新型調(diào)控因子成為高氧性肺損傷防治的新切入點(diǎn)。近年來由肺神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞(Pulmonary neuroendocrine cell,PNECs)分泌的感覺神經(jīng)肽類遞質(zhì)的作用開始被注意,神經(jīng)肽類遞質(zhì)(Neuropeptides,Ne )是一種細(xì)胞調(diào)控因子或細(xì)胞外信使分子,是神經(jīng)、內(nèi)分泌和免疫共同識別的信號物質(zhì)之一,“神經(jīng)?體液?免疫”網(wǎng)絡(luò)對創(chuàng)傷修復(fù)過程起調(diào)控作用。神經(jīng)肽P物質(zhì)(substance P,SP)是最早發(fā)現(xiàn)的速激肽家族神經(jīng)肽,廣泛分布于氣道上皮細(xì)胞層內(nèi)、肺血管、氣管、支氣管平滑肌層內(nèi)及腺體和支氣管神經(jīng)節(jié)周圍,新近研究表明SP在修復(fù)細(xì)胞的增殖、遷移、分化方面有重要作用,SP對角質(zhì)細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、成骨細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞均有明顯的促增殖分化作用,呼吸器官含有豐富的SP,而其對高氧肺損傷AECⅡ修復(fù)作用尚不清楚。 細(xì)胞凋亡是基因調(diào)控下細(xì)胞積極死亡的形式,往往涉及一些信號途徑的參與,假如SP是AECⅡ新的調(diào)控因子,那么它是通過什么分子機(jī)制來現(xiàn)實這一調(diào)控過程?絲裂素活化蛋白激酶(Mitogen activated protein kinases , MAPKs )途徑,包括細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(Extracellular signal-regulated kinase ,ERK),c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)和P38激酶(P38MAPK),是細(xì)胞增殖、分化等信息傳遞途徑的交匯點(diǎn)和共同通路。SP能否促進(jìn)高氧后損傷的AECⅡ的修復(fù),且是否與調(diào)控MAPKs有關(guān),目前尚不清楚。 綜上所述,SP作為重要的感覺神經(jīng)肽類遞質(zhì),可能通過MAPK途徑參與高氧性肺損傷AECⅡ的修復(fù),從而減輕高氧性損傷,將是未來高氧ALI和BPD防治的可行性途徑。本課題以原代培養(yǎng)的早產(chǎn)鼠AECⅡ為研究對象,通過建立體外細(xì)胞氧化損傷模型,觀察高氧暴露不同時間及SP干預(yù)對AECⅡ增殖存活的影響及MAPKs的調(diào)控機(jī)制。 第一部分原代早產(chǎn)大鼠肺泡II型上皮細(xì)胞分離、純化、培養(yǎng)及鑒定 背景 氧氣療法是臨床上治療新生兒急性呼吸衰竭常用且有效的措施,但長時間高氧暴露可引起氧化應(yīng)激性肺損傷。高濃度氧氣(氧氣體積分?jǐn)?shù)950ml/L,簡稱高氧)暴露是導(dǎo)致氧化應(yīng)激性肺損傷的主要致病因素。高氧肺損傷是彌散性肺泡炎和損傷后修復(fù)重建的復(fù)雜病理生理過程,其治療的根本難題在于內(nèi)源性肺泡上皮不能恢復(fù),肺組織修復(fù)過程中不是由正常的肺泡上皮替代,而是由成纖維細(xì)胞替代導(dǎo)致肺組織修復(fù)障礙。肺泡上皮損傷后修復(fù)主要依賴于肺泡上皮的干細(xì)胞——AECⅡ的增殖和分化以覆蓋肺泡表面,完成肺泡的修復(fù)。AECⅡ體積較小、呈立方形,占肺泡上皮細(xì)胞數(shù)的60%左右,能通過增殖、鋪展、遷移,并最終轉(zhuǎn)化為肺泡I型上皮細(xì)胞(Alveolar type I epithelial cells, AEC I ),恢復(fù)肺泡上皮正常的形態(tài)和功能。胎肺發(fā)育晚期肺組織主要由AECⅡ和肺成纖維細(xì)胞(Lung fibroblast ,LF)組成,因此胎肺AECⅡ和LF的分離、純化和原代培養(yǎng)對體外研究肺發(fā)育和早產(chǎn)兒肺部疾病至關(guān)重要,但早產(chǎn)大鼠AECⅡ細(xì)胞的原代分離、純化技術(shù)難度大,培養(yǎng)條件相對要求高;特別是AECⅡ不能傳代培養(yǎng),分離高純度的細(xì)胞仍有較大困難。本研究的目的是掌握早產(chǎn)大鼠AECⅡ的分離、純化和培養(yǎng)技術(shù),以獲得數(shù)量足夠、純度高的AECⅡ,滿足下一步實驗的需要。 目的 確定早產(chǎn)大鼠原代AECⅡ分離、純化、培養(yǎng)的技術(shù)方法,為研究高氧刺激下AECⅡ存活、凋亡和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制提供數(shù)量足夠和高純度的AECⅡ,以滿足實驗的需要。 方法 成年SD(Sprague-Dawley,SD)大鼠,購自第三軍醫(yī)大學(xué)大坪三院實驗動物中心。雌雄按1:1合籠交配,找到陰栓日計為妊娠第1天。取胎齡19天的早產(chǎn)鼠分離AECⅡ,步驟如下:水合氯醛麻醉孕19天大鼠,剖宮取出胎鼠,分離胎肺,去除氣管、支氣管等非肺組織后剪至1mm3大小,加入0.25%胰酶消化25-30分鐘,完全培養(yǎng)基終止消化。100目篩網(wǎng)過濾,濾液800rpm離心后棄上清,沉淀加入0.1%的膠原酶Ⅰ消化45分鐘后離心去上清,沉淀重懸在含10%胎牛血清、100u/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基中,接種至培養(yǎng)瓶,培養(yǎng)30分鐘后貼壁的為LF,未貼壁的為AECⅡ,吸出,800rpm離心后接種至新的培養(yǎng)瓶。如此反復(fù)貼壁3次,以純化AECⅡ。最后未貼壁的細(xì)胞按濃度1.5×106/ml接種至6孔培養(yǎng)板,培養(yǎng)12小時后棄除未貼壁的細(xì)胞,此時貼附在瓶底的細(xì)胞即為AECⅡ。繼續(xù)接種于6孔培養(yǎng)板或96孔培養(yǎng)板,更換新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)12h備用。臺盼藍(lán)拒染法測定細(xì)胞活力、改良巴氏染色法確定細(xì)胞純度、透射電鏡(Transmitting electron microscopy, TEM)鑒定細(xì)胞;在體外培養(yǎng)細(xì)胞不同的時間(12、24、和48h)觀察細(xì)胞的性狀和形態(tài)變化。 結(jié)果 1.每3-5只19天胎齡早產(chǎn)鼠經(jīng)分離培養(yǎng)可獲AECⅡ數(shù)約為(36±5)×106。 2.臺盼藍(lán)拒染法測定細(xì)胞活力 90%。 3.改良巴氏染色法證實細(xì)胞純度 90%。 4.電鏡下觀察到AECⅡ典型細(xì)胞結(jié)構(gòu)——板層小體。 5.體外培養(yǎng)12至24 h時AECⅡ生長良好,細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有較多顆粒;48h以后細(xì)胞呈長索形,細(xì)胞內(nèi)顆粒減少,并出現(xiàn)空泡。 結(jié)論 本實驗觀察到19d胎鼠AECⅡ原代培養(yǎng)12h ,接近融合狀態(tài),原代培養(yǎng)第24～48h,增殖代謝旺盛,生長狀態(tài)最佳,可獲得高產(chǎn)量、高純度、高活力的原代AECⅡ,此時適合做體外研究。 第二部分高氧暴露及神經(jīng)肽P物質(zhì)干預(yù)對早產(chǎn)大鼠肺泡II型上皮細(xì)胞的影響 背景 氧療是臨床上用于提高血氧飽和度、改善組織缺氧狀態(tài)的一種輔助治療手段,高濃度氧氣(氧氣體積分?jǐn)?shù) 950ml/L,簡稱高氧)機(jī)械通氣是治療嚴(yán)重呼吸衰竭(Respiratory failure,RF),尤其是急性呼吸窘迫綜合征(Acute respiratory distress syndrome,ARDS)的常用措施,但常時間暴露在高氧狀態(tài)下可產(chǎn)生過量的活性氧自由基(Reactive oxygen species ,ROS),引起細(xì)胞內(nèi)氧化/抗氧化體系失衡而導(dǎo)致氧化應(yīng)激性肺損傷,引起早產(chǎn)兒肺發(fā)育受阻,形成早產(chǎn)兒BPD。如何促進(jìn)高氧損傷后的修復(fù),防治BPD是臨床工作者十分關(guān)注的問題。高氧肺損傷時,由于AECI較AECII更易受高濃度氧的損傷,首先受到破壞,AECⅡ是肺組織中的重要細(xì)胞,在肺泡受到損傷時能轉(zhuǎn)化為AECI修復(fù)受損肺泡,由于AECI是高度分化的細(xì)胞,不可能再生,所以肺泡的損傷修復(fù)完全依賴于AECⅡ的增殖分化。近年研究發(fā)現(xiàn),在肺發(fā)育關(guān)鍵階段,高氧可引起肺的重塑及生長異常,其中一個主要因素是其導(dǎo)致了AECII的凋亡。但細(xì)胞凋亡在高氧肺損傷中的作用仍不清楚,多數(shù)學(xué)者報道高氧誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡與肺損傷的程度成正相關(guān)。另外,對于細(xì)胞凋亡與肺纖維化關(guān)系的研究表明,肺泡和細(xì)支氣管上皮細(xì)胞的凋亡可能是導(dǎo)致肺纖維化的一種機(jī)制。據(jù)此推測如果采取一定措施防止AECII的凋亡,增加AECII增值、移行,可能對高氧肺損傷后的BPD起到防治作用 以往的研究多集中在如何阻斷有害因素對AECⅡ的損害,更多的重視免疫源性因素如炎癥細(xì)胞、細(xì)胞因子對創(chuàng)傷修復(fù)的影響,而對損傷后如何保護(hù)和促進(jìn)AECⅡ修復(fù)重建研究甚少,忽視了“神經(jīng)?體液?免疫”網(wǎng)絡(luò)對修復(fù)過程的調(diào)控。故尋找促進(jìn)AECⅡ主動修復(fù)的新型調(diào)控因子成為高氧性肺損傷防治的新切入點(diǎn)。神經(jīng)肽類遞質(zhì)(Neuropeptides,Ne )是一種細(xì)胞調(diào)控因子或細(xì)胞外信使分子,是神經(jīng)、內(nèi)分泌和免疫共同識別的信號物質(zhì)之一。新近研究表明感覺神經(jīng)肽SP在修復(fù)細(xì)胞的增殖、遷移、分化方面有重要作用,在成體皮膚創(chuàng)傷愈合中已證實SP不僅啟動愈合早期的神經(jīng)源性炎性反應(yīng),同時對修復(fù)細(xì)胞增殖、再生和瘢痕形成密切相;氣道SP主要來自感覺神經(jīng)c-纖維末端,分布于氣道上皮細(xì)胞層內(nèi)、肺血管、氣管、支氣管平滑肌層內(nèi)及腺體和支氣管神經(jīng)節(jié)周圍。氣道神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和肺泡巨噬細(xì)胞都能合成和分泌SP;SP特異性受體可見于氣道平滑肌、粘膜下腺、血管內(nèi)皮,一些炎性細(xì)胞也表達(dá)SP受體。呼吸器官含有豐富的SP,但其在肺損傷修復(fù)中的地位和作用國內(nèi)外尚無相關(guān)報道。本部分研究高氧暴露不同時間及SP干預(yù)對AECⅡ增殖存活的影響和高氧暴露不同時間早產(chǎn)鼠肺組織SP含量的動態(tài)變化。 目的 1.采用高氧和無血清培養(yǎng)基建立原代早產(chǎn)大鼠AECⅡ的氧化損傷模型。 2.研究高氧暴露不同時間及SP干預(yù)對AECⅡ形態(tài)、膜脂質(zhì)過氧化程度指標(biāo)丙二醛(MDA)、總抗氧化能力(TAOC)、存活和凋亡的影響,探討AECⅡ損傷與高氧作用的時間效應(yīng)關(guān)系及SP干預(yù)對AECⅡ損傷的作用。 3.早產(chǎn)鼠高氧肺損傷動物模型的制備及SP含量的測定。 方法 1.分離、純化清潔級Spraque-Dawley早產(chǎn)大鼠的AECⅡ,臺盼蘭拒染法鑒定細(xì)胞活性,改良巴氏染色法鑒定細(xì)胞純度。將AECⅡ隨機(jī)分為:空氣暴露組、高氧暴露組、SP干預(yù)空氣暴露組、SP干預(yù)高氧暴露組,空氣暴露組氧體積分?jǐn)?shù)為210ml/L,高氧暴露組氧體積分?jǐn)?shù)為950ml/L),SP干預(yù)組于暴露前加入SP 1×10-6mol/L,在置于氧體積分?jǐn)?shù)為210ml/L和950ml/L中各組分別暴露12、24、和48h,電鏡觀察AECⅡ的形態(tài)變化;采用分光光度計測定各組丙二醛(MDA)、總抗氧化能力(TOAC)濃度;噻唑蘭檢測法(MTT法)及流式細(xì)胞儀測定其增殖率和凋亡率,以明確細(xì)胞損傷與高氧作用的時間效應(yīng)關(guān)系及SP干預(yù)對AECⅡ損傷的作用。 2.剖宮取出SD大鼠孕2l d(足月為22 d)早產(chǎn)鼠,隨機(jī)分為空氣暴露組和高氧暴露組,空氣暴露組氧體積分?jǐn)?shù)為210ml/L,高氧暴露組氧體積分?jǐn)?shù)為950ml/L,分別于暴露3,7,14 d后,取肺組織測定其SP含量。 結(jié)果 1.與空氣暴露組相比,AECⅡ高氧暴露后12h,細(xì)胞間隙稍增寬,部分細(xì)胞內(nèi)可見反光增強(qiáng)的空泡;高氧暴露后24h,細(xì)胞間隙增寬,細(xì)胞體積減小,胞內(nèi)空泡增多,部分細(xì)胞核濃縮變小,細(xì)胞內(nèi)顆粒(板層小體)減少;高氧暴露后48h,大量細(xì)胞變圓、皺縮明顯,細(xì)胞脫壁,培養(yǎng)上清液中可見漂浮的細(xì)胞和細(xì)胞碎片;透射電鏡下可觀察到典型的凋亡細(xì)胞(細(xì)胞體積變小,細(xì)胞質(zhì)濃縮,胞膜內(nèi)陷,細(xì)胞核固縮,核染色質(zhì)濃縮并凝結(jié)成塊)和凋亡小體圍繞。與空氣暴露組比較,發(fā)現(xiàn)隨高氧暴露時間的延長,細(xì)胞的形態(tài)損害隨之加重。而SP干預(yù)后高氧暴露12、24及48h,較高氧暴露組同時間點(diǎn)比較細(xì)胞器變化減輕。 2.高氧暴露及SP干預(yù)高氧暴露12、24及48h對AECⅡ氧化損傷的影響:與空氣組比較,高氧組12、24及48h TAOC顯著下降,MDA明顯升高,而與SP干預(yù)高氧暴露組比較,其TAOC仍低于空氣組,但較高氧組明顯升高,同時MDA雖高于空氣組,但較高氧組明顯降低。 3. MTT實驗結(jié)果表明:與空氣暴露組比較,高氧暴露組12、24及48h AECⅡ增殖活性顯著下降,AECⅡ存活率呈下降明顯(P 0.05)。隨作用時間的延長,細(xì)胞存活率逐漸下降,各組間比較有顯著差異(P 0.05)。而與SP干預(yù)高氧暴露組比較,其增殖活性仍低于空氣暴露組,但較高氧暴露組明顯升高。 4.流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期檢測AECⅡ凋亡結(jié)果顯示:與空氣暴露組比較,高氧暴露組12、24及48h,隨高氧作用時間的延長, AECⅡ凋亡率呈明顯上升趨勢(P 0.05)。而與SP干預(yù)高氧暴露組比較,同時間點(diǎn)凋亡率雖高于空氣暴露組,但較高氧暴露組明顯降低。 5.與空氣暴露組比較,高氧暴露3、7、14 d早產(chǎn)鼠肺組織SP含量顯著降低(P0.01),且隨高氧暴露的延長,SP含量降低明顯(高氧暴露組間比較,P0.01)。 結(jié)論 1.高氧刺激可誘導(dǎo)AECⅡ發(fā)生凋亡,并以時間依賴的方式加重AECⅡ損傷。 2. SP干預(yù)后可減少M(fèi)DA產(chǎn)生,提高TAOC水平,提示SP干預(yù)后可增加機(jī)體AOE的活性,使氧化和抗氧化失衡狀態(tài)得到糾正,有助于減輕和耐受高氧肺損傷。 3. SP干預(yù)后可減少高氧所致AECⅡ的凋亡率增加存活率,提示SP可以減輕AECⅡ的氧化損傷,對氧化應(yīng)激狀態(tài)下的AECⅡ可能起到保護(hù)作用。 4.高氧暴露可導(dǎo)致SP含量的動態(tài)變化,提示高氧暴露后導(dǎo)致氣道感覺神經(jīng)c-纖維末端SP分泌不足,局部SP含量的降低可能與AECⅡ的損傷程度有關(guān)。 第三部分高氧暴露及神經(jīng)肽P物質(zhì)干預(yù)調(diào)控早產(chǎn)大鼠肺泡II型上皮細(xì)胞修復(fù)的MAPKs信號機(jī)制 背景 氧氣療法是臨床上治療急性呼吸衰竭常用且有效的措施,但長時間吸人高濃度氧,肺直接暴露于高氧中,引起肺泡毛細(xì)血管通透性增高、肺泡液滲出增多、炎性損傷、纖維蛋白沉積及肺表面活性物質(zhì)活性降低等非特異性改變,引起氧化應(yīng)激性肺損傷致BPD,BPD是早產(chǎn)兒長時間吸入高體積分?jǐn)?shù)氧(高氧)治療的常見并發(fā)癥。 第二部分證實了高氧以時間依賴的方式誘導(dǎo)AECⅡ損傷,高氧刺激可誘導(dǎo)AECⅡ發(fā)生凋亡;SP干預(yù)后可減少高氧所致AECⅡ的凋亡率增加存活率,對氧化應(yīng)激狀態(tài)下的AECⅡ可能起到保護(hù)作用。細(xì)胞凋亡是基因調(diào)控下細(xì)胞積極死亡的形式,往往涉及一些信號途徑的參與,SP是AECⅡ新的調(diào)控因子,那么它是通過什么分子機(jī)制來實現(xiàn)這一調(diào)控過程?絲裂原活化蛋白激酶(mitogen.activated protein kinases,MAPKs)信號傳遞通路在介導(dǎo)高氧肺損傷過程中扮演重要角色,MAPKs主要包括3個家族成員:胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular si gna 1-regulated kinases,ERKs),C-JUN氨基端激(C-JUN-NH2.terminal kinases,JNKs)和p38激酶。目前認(rèn)為,MAPK信號通路是細(xì)胞外的各種信號從細(xì)胞表面?zhèn)鲗?dǎo)到細(xì)胞核內(nèi)部的重要通道,能被多種刺激因素激活而介導(dǎo)細(xì)胞的凋亡。MAPKs是細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)、增殖、分化和凋亡等信息傳遞途徑的交匯點(diǎn)和共同通路,細(xì)胞外各種刺激信號可通過細(xì)胞內(nèi)不同的信息傳遞通路,共同交匯于MAPKs。已有研究證實,暴露于95%氧氣以及H2O2應(yīng)激可觸發(fā)轉(zhuǎn)錄因子AP-1及MAPK家族p38、JNK成員的持續(xù)激活,從而介導(dǎo)高氧所致腫脹性細(xì)胞死亡以及細(xì)胞凋亡,且細(xì)胞的存活率在特異性抑制劑抑制MAPK活化的同時得到明顯的改善;維甲酸通過調(diào)控MAPK途徑減輕早產(chǎn)大鼠高氧肺損傷。MAPKs通路參與了高氧氧化應(yīng)激下AECⅡ凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo),并對AECⅡ起促凋亡的作用。SP干預(yù)是否也可以通過MAPKs通路,對AECⅡ的凋亡存活產(chǎn)生影響?其調(diào)控機(jī)制尚不清楚。 本部分進(jìn)一步研究高氧暴露及SP干預(yù)對原代培養(yǎng)的AECⅡ的損傷及保護(hù)中是否有MAPK信號的參與及MAPK信號的調(diào)控機(jī)制。 目的 1.采用高氧和無血清培養(yǎng)基建立原代早產(chǎn)大鼠AECⅡ的氧化損傷性細(xì)胞模型。 2.研究高氧暴露不同時間及SP干預(yù)對AECⅡ形態(tài)、存活和凋亡的影響,探討AECⅡ損傷與高氧作用的時間效應(yīng)關(guān)系及SP干預(yù)對AECⅡ損傷的作用。 3.研究高氧氧化應(yīng)激及SP干預(yù)下AECⅡ凋亡過程中MAPKs的活化情況,從而研究MAPKs對AECⅡ凋亡的作用及SP干預(yù)后對MAPKs信號機(jī)制的調(diào)控。 方法 分離、純化清潔級Spraque-Dawley早產(chǎn)大鼠的AECⅡ,臺盼蘭拒染法鑒定細(xì)胞活性,改良巴氏染色法鑒定細(xì)胞純度。將AECⅡ隨機(jī)分為:空氣暴露組、高氧暴露組、SP干預(yù)空氣暴露組、SP干預(yù)高氧暴露組,空氣暴露組氧體積分?jǐn)?shù)為210ml/L,高氧暴露組氧體積分?jǐn)?shù)為950ml/L ,SP干預(yù)組于暴露前加入SP 1×10-6mol/L,在置于氧體積分?jǐn)?shù)為210ml/L和950ml/L中各組分別暴露12、24、和48h,蛋白質(zhì)免疫印跡法(Western blot)檢測各組各時間點(diǎn)磷酸化總ERKs、JNKs或p38表達(dá)。 結(jié)果 1.高氧暴露后AECⅡ12、24及48h ,發(fā)現(xiàn)高氧暴露刺激后很快誘導(dǎo)p-ERK表達(dá),12、24及48h時p-ERK表達(dá)與空氣暴露組相比顯著增加,其中48h時p-ERK蛋白條帶表達(dá)最強(qiáng), SP干預(yù)后高氧暴露12、24及48h,較高氧組同時間點(diǎn)比較p-ERK表達(dá)更明顯。 2.高氧暴露后AECⅡ12、24及48h ,發(fā)現(xiàn)高氧暴露刺激后很快誘導(dǎo)p- p38表達(dá),12、24及48h時p- p38表達(dá)與空氣暴露組相比顯著增加,其中48h時p- p38蛋白條帶表達(dá)最強(qiáng), SP干預(yù)后高氧暴露12、24及48h,較高氧組同時間點(diǎn)比較p- p38表達(dá)減弱。 3.高氧暴露后AECⅡ12、24及48h ,發(fā)現(xiàn)高氧暴露刺激后很快誘導(dǎo)p-JNK表達(dá),12、24及48h時p-JNK表達(dá)與空氣暴露組相比顯著增加,其中48h時p-JNK蛋白條帶表達(dá)最強(qiáng),SP干預(yù)后高氧暴露12、24及48h,較高氧暴露組同時間點(diǎn)比較p-JNK表達(dá)減弱。 結(jié)論 本研究發(fā)現(xiàn)高氧暴露刺激AECⅡ后能很快誘導(dǎo)MAPKs表達(dá),在48h左右達(dá)到峰值,使用SP干預(yù)MAPKs信號通路后,在高氧刺激下SP干預(yù)組細(xì)胞的凋亡率明顯低于高氧組的凋亡率,而其細(xì)胞存活率明顯高于高氧組的存活率,說明MAPKs信號介導(dǎo)了AECⅡ的凋亡,SP干預(yù)后進(jìn)一步激活胞外信號調(diào)節(jié)激酶并抑制C-JUN氨基端激酶和p38激酶信號激活對氧化應(yīng)激狀態(tài)下的AECⅡ有保護(hù)作用。
【圖文】：

圖 1 臺盼藍(lán)染色(×100)Fig 1 Trypan blue staining of AECⅡ cells(×100)CⅡ在體外培養(yǎng) 12 小時 B： AECⅡ在體外

C：AECⅡ在體外培養(yǎng) 48 小時圖 2 在體外培養(yǎng)不同時間后 AEFig 2 The morphological changes of primary AECpurifiation in vitro注： 示分裂期
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號】：R722.6

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本文編號：2666632