【摘要】： 目的 探討Notch信號(hào)在正常神經(jīng)上皮發(fā)育及神經(jīng)管發(fā)育過(guò)程中的作用,試圖揭示Notch信號(hào)通路在神經(jīng)管畸形發(fā)生過(guò)程中的分子機(jī)制,為進(jìn)一步探討Notch信號(hào)在胚胎神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生和發(fā)育過(guò)程中的作用及可能的機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法 采用全胚胎原位雜交技術(shù)觀察到Notch在正常胚胎早期發(fā)育中時(shí)空表達(dá)規(guī)律,尤其在神經(jīng)胚形成階段;利用喂服過(guò)量全反式維甲酸(alltransretinoic acid,ATRA)誘導(dǎo)NTDs模型,觀察NTDs的胚胎早期發(fā)育過(guò)程中Notch的表達(dá)變化:采用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)Notch信號(hào)調(diào)節(jié)的發(fā)育相關(guān)基因在正異常鼠胚的表達(dá);并利用Western blots觀察Notch蛋白的胞內(nèi)活性形式NICD(the intracellular domain of Notch)胚胎早期發(fā)育中的變化。 結(jié)果 一、Notch在小鼠神經(jīng)胚發(fā)育中的表達(dá) 采用全胚胎原位雜交可觀察到在小鼠胚胎發(fā)育的9.5～11.5天(E9.5d～E11.5d)NotchmRNA的表達(dá)情況,陽(yáng)性反應(yīng)物成黃綠色。在E9.5d隨著神經(jīng)管的逐漸關(guān)閉,Notch mRNA在前腦泡有表達(dá),尾部也有少許表達(dá),到E10.5d,陽(yáng)性信號(hào)由前腦泡轉(zhuǎn)移至中腦泡乃至整個(gè)脊柱,E11.5d時(shí)在整個(gè)腦泡以及脊柱中仍有Notch mRNA的表達(dá),但表達(dá)強(qiáng)度不如E10.5d的強(qiáng)。 二、Notch與ATRA致小鼠NTDs的關(guān)系 與正常對(duì)照組相比,喂服ATRA后的孕鼠在E9.5～10.5d可觀察到前腦頂部和后腦未閉合的畸形胚胎,在少數(shù)胚胎可觀察到整個(gè)神經(jīng)管未閉合,呈開放狀態(tài)。表明該劑量的ATRA(50mg/kg)可以造成CNS發(fā)育的缺陷。 與正常鼠胚相比,ATRA致NTDs鼠胚在E9.5d Notch mRNA的表達(dá)量要比正常的鼠胚明顯增多,而且表達(dá)部位也有增加,不僅在前腦泡有表達(dá),在未完全形成的脊柱上也有表達(dá);E10.5d Notch mRNA的表達(dá)量較正常鼠胚減少,在腦泡Notch mRNA.表達(dá)的陽(yáng)性信號(hào)要弱于正常鼠胚;E11.5d胚胎神經(jīng)管關(guān)閉,Notch mRNA的表達(dá)與正常鼠胚相比無(wú)論表達(dá)量還是表達(dá)部位都沒(méi)有明顯變化。 三、Notch信號(hào)調(diào)節(jié)的發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá) 通過(guò)凝膠圖像分析,計(jì)算所得灰度比值來(lái)反映各基因mRNA的表達(dá),將對(duì)照組(正常神經(jīng)管組織)和NTDs組行兩樣本t檢驗(yàn),得出NTDs組與對(duì)照組組內(nèi)各樣本間無(wú)差異(P＞0.05);E9.5d時(shí)Notchl在NTDs組表達(dá)高于對(duì)照組(P＜0.05),其它三個(gè)基因RBP-Jk、PS1、Hes1在NTDs組和對(duì)照組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;E10.5d時(shí)Notchl和RBP-Jk的表達(dá)在對(duì)照組和NTDs組沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05),而PS1和Hes1的表達(dá)存在差異,PS1和Hes1在NTDs中的表達(dá)明顯低于對(duì)照組,具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);E11.5d,四個(gè)基因均未有差異表達(dá)。在正常神經(jīng)管組織中,胚胎發(fā)育不同時(shí)間(E9.5-11.5d)Notchl的表達(dá)在E10.5d高于E9.5d,但與E11.5相近;RBP-Jk的表達(dá)在E10.5d高于E9.5d和E11.5d;Hes1的表達(dá)也是如此;而PS1隨天數(shù)表達(dá)增加;在ATRA致小鼠NTDs神經(jīng)管組織中,Notchl和RBP-Jk的表達(dá)在E9.5-11.5d幾天內(nèi)沒(méi)有較大的變化;PS1的表達(dá)在E9.5-11.5d內(nèi),降低后增高,Hes1的表達(dá)也是先降低后增加。 四、Notch蛋白胞內(nèi)區(qū)NICD的定量 采用凝膠成像及分析系統(tǒng),于可見(jiàn)光下采集蛋白條帶圖像,通過(guò)與相應(yīng)內(nèi)參GAPDH條帶密度比較,計(jì)算各個(gè)條帶密度相對(duì)比值。以此比值來(lái)反映NICD蛋白的表達(dá)量。對(duì)所獲得的數(shù)據(jù)采用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。將各期對(duì)照組(正常腦組織)和NTDs組行兩樣本t檢驗(yàn),得出E9.5d時(shí)NICD的表達(dá)沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P＞0.05,而E10.5d時(shí)NICD蛋白表達(dá)在同期對(duì)照組和NTDs組有顯著差異P＜0.05,到E11.5d時(shí)核內(nèi)NICD的變化不大,沒(méi)有差異。免疫組化顯示Notch胞內(nèi)區(qū)NICD在神經(jīng)管周圍神經(jīng)上皮中有表達(dá)。 目的 探討山西省漢族人群MTHFRC677T、RFC-1A80G基因多態(tài)性狀況及與神經(jīng)管畸形(Neural Tube Defects簡(jiǎn)稱NTDs)的相關(guān)性，明確山西神經(jīng)管畸形發(fā)病的危險(xiǎn)因素，為預(yù)防和控制NTDs發(fā)生提供科學(xué)的依據(jù)。 方法 采用聚合酶鏈反應(yīng)—限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性方法(PCR-RFLP)分析38例曾經(jīng)生育過(guò)NTDs．兒婦女和80例正常對(duì)照的MTHFRC677T和RFC-1A80G多態(tài)性分布。根據(jù)Van Allen's分類法將神經(jīng)管畸形分為高畸形組(包括腰椎或腰骶脊柱裂)和低畸形組(包括無(wú)腦，枕部腦膨出)。 結(jié)果 1．病例組與對(duì)照組相比：MTHFR基因677位點(diǎn)基因型頻率沒(méi)有差別；并且二者在等位基因頻率上也無(wú)顯著差異。但是在生育低畸形兒母親組T等位基因頻率高于對(duì)照組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(OR=0．32(95％CI0．11-0．9)，p=0．027)：677T／T基因型頻率在生育低畸形兒組與對(duì)照組中沒(méi)有顯著差異p=0．08。 2．病例組與對(duì)照組相比：RFC-1 80位點(diǎn)基因型頻率存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，OR=8．85(95％CI 1．70-44．3，)，p=0．008，生育畸形兒母親組(病例組)G等位基因頻率為47％要高于對(duì)照組32％，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0．021，OR=1．97，，95％CI=1．12-3．44)：生育高畸形兒母親組和對(duì)照組相比基因型頻率AG和AA存在顯著差異(p=0．009，OR=6．7，95％CI=1．47-30．9)，GG和AA存在顯著差異(P=0．005，OR=20．6，95％CI=163．8)。而在生育低畸形兒母親組沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)論 1．MTHFRC677T突變尚不能被看作是山西地區(qū)漢族人群神經(jīng)管畸形發(fā)病的獨(dú)立遺傳因素； 2．RFC-1A80G單核苷酸多態(tài)性可能與山西地區(qū)漢族人群神經(jīng)管畸形遺傳易感性有關(guān)。
【圖文】：

山西醫(yī)科大學(xué)碩十學(xué)位論文圖1一2一 AEg.sd全胚胎原位雜交示 NotchmRNA圖1一2一 BE10.sd全胚胎原位雜交示 NotchmRNA圖1一2一 CEll.sd全胚胎原位雜交示 NotchmRNA4討論神經(jīng)管的發(fā)生是一個(gè)多因素參與的高度復(fù)雜的胚胎學(xué)事件，從片層狀的外胚層神經(jīng)板逐漸演變?yōu)殚L(zhǎng)管狀神經(jīng)管的過(guò)程又稱為神經(jīng)胚形成(neurulation)。形成神經(jīng)管的神經(jīng)上皮細(xì)胞源于神經(jīng)外胚層細(xì)胞，神經(jīng)外胚層原神經(jīng)基因的活動(dòng)將導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)大部分表層的形成。這一過(guò)程可以被神經(jīng)源基因(原神經(jīng)基因)的作用所抑制，神經(jīng)源基因編碼一種被外胚層細(xì)胞應(yīng)用、限制神經(jīng)祖細(xì)胞數(shù)量的細(xì)胞通訊機(jī)制蛋白。神經(jīng)源基因功能缺失將導(dǎo)致擴(kuò)展的表皮祖細(xì)胞上神經(jīng)祖細(xì)胞數(shù)量增加，其中Notch為編碼膜蛋白的神經(jīng)源基因。本實(shí)驗(yàn)采用全胚胎原位雜交技術(shù)，對(duì)整個(gè)胚胎進(jìn)行原位雜交，觀察目的基因Notch的表達(dá)、分布等時(shí)空變化，此法組織定位準(zhǔn)確也更經(jīng)濟(jì)。我們檢測(cè)了E9.5一 11.sd神經(jīng)胚形成過(guò)程中 NotchmRNA表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)Eg.sd時(shí)整個(gè)鼠胚只有前腦泡和尾部有表達(dá)

吸收胎較多。解剖顯微鏡下觀察到胚胎發(fā)育遲緩，死胎明顯增多，形態(tài)多樣，主要為前腦頂部和后腦未閉合，在少數(shù)胚胎可發(fā)現(xiàn)整個(gè)神經(jīng)管未閉合，呈開放狀態(tài)。 El1.5d以后的孕鼠子宮多恢復(fù)正常狀態(tài)，吸收胎減少。(如圖1一4) 123圖1一3正常小鼠胚胎1為E&sd小鼠胚胎，胚體尚未完全轉(zhuǎn)體，神經(jīng)管沒(méi)有閉合;2為Eg.sd鼠胚;3為 EI0.5鼠胚圖1一 4NTDs鼠胚，表現(xiàn)為露腦、無(wú)腦、脊柱裂 1.3.2NTDs鼠胚 NofchmRNA全胚胎原位雜交檢測(cè)結(jié)果:與正常鼠胚相比，ATRA致NTDs鼠胚在 Eg.sdNotchmRNA的表達(dá)量要比正常的鼠胚明顯增多，而且表達(dá)部位也增加，不僅在前腦泡有表達(dá)，在體節(jié)上也有表達(dá)(見(jiàn)圖1一5一A)，而正常鼠胚在E10.sd時(shí)在體節(jié)中才有Notch的表達(dá);NTDs鼠胚E10.sdNotchmRNA的表達(dá)量較正常鼠胚減少，在腦泡 NotchmRNA表達(dá)的陽(yáng)性信號(hào)要弱于正常鼠胚(見(jiàn)圖卜5一B);Ell.sd胚胎神經(jīng)管關(guān)閉，NotchmRNA的表達(dá)與正常鼠胚相比無(wú)論表達(dá)量
【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號(hào)】：R748

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本文編號(hào)：2666494