【摘要】：目的:先天性甲狀腺功能減退癥(Congenital hypothyroidism,CH)是新生兒最常見的內(nèi)分泌疾病,CH大部分是由甲狀腺發(fā)育異常(Thyroid dysgenesis,TD)導(dǎo)致的,而近年來有國外報道稱在CH患兒中發(fā)現(xiàn)了煙酰胺核苷酸轉(zhuǎn)氫酶(NNT)的缺陷,但是否致病或者致病機(jī)理并不清楚。本研究對中國山東地區(qū)CH伴TD患兒進(jìn)行了NNT基因的突變篩查,并探究了該基因與CH的關(guān)系以試圖發(fā)現(xiàn)新的NNT基因致病突變。之后對篩查出的突變進(jìn)行進(jìn)一步的功能分析,來探究突變可能帶來的異常,試圖揭示其致病機(jī)理,并最終服務(wù)于臨床,為CH的早期篩查及時診斷和治療提供更多依據(jù),更好的降低CH的危害。方法:本研究選取100例來自山東不同地區(qū)的CH伴TD患兒及120例健康兒童進(jìn)行篩查,所有患兒均已排除了促甲狀腺激素受體(TSHR),甲狀腺轉(zhuǎn)錄因子1(NKX2.1)、甲狀腺轉(zhuǎn)錄因子2(FOXE1)、配對盒基因8(PAX8),NK同源盒5基因(NKX2.5)等經(jīng)典CH致病基因的異常。從所有220人外周血血凝塊中分別提基因組DNA,并使用酶標(biāo)儀對提取的DNA進(jìn)行質(zhì)檢,設(shè)計21對擴(kuò)增引物擴(kuò)增NNT基因的21個編碼區(qū)域,擴(kuò)增完畢后通過瓊脂糖凝膠電泳對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行質(zhì)檢,合格者回收后進(jìn)行Sanger測序,將測序結(jié)果與NCBI中對應(yīng)的序列(NM_012343.3)進(jìn)行比對以發(fā)現(xiàn)NNT基因的突變。之后對所發(fā)現(xiàn)的突變進(jìn)行蛋白序列同源性比對以獲取更多信息。此外,合成野生型NNTpc DNA3.1重組質(zhì)粒并誘導(dǎo)突變型NNTpc DNA3.1重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞,在培養(yǎng)48h后進(jìn)行蛋白提取,BCA法定量后通過Western Blot檢測NNT蛋白的表達(dá)量,同時使用Amplex Red方法檢測轉(zhuǎn)染48h后各孔在560nm處的吸光度以對各孔過氧化氫進(jìn)行定量。Western Blot實驗及Amplex Red實驗重復(fù)三次后統(tǒng)計并分析結(jié)果。最后對突變位點進(jìn)行蛋白疏水性分析以預(yù)測突變對蛋白穩(wěn)定性的影響結(jié)果:本研究共發(fā)現(xiàn)3例NNT基因的突變:c.811GT,p.A271S;c.2078GA,p.R693H;c.2581GA,p.V861M。這三例突變均為錯義突變,攜帶這三個突變的患者甲狀腺B超均顯示甲狀腺缺如。蛋白序列同源性比較發(fā)現(xiàn)這三個突變均位于蛋白保守區(qū)域。Western Blot結(jié)果顯示此三突變并未改變NNT蛋白的表達(dá)量而Amplex Red結(jié)果顯示這三個突變也未改變細(xì)胞產(chǎn)生過氧化氫的量。但疏水性分析發(fā)現(xiàn)突變改變了蛋白一些區(qū)域的疏水性。結(jié)論:本研究是國內(nèi)首次對CH伴TD患者進(jìn)行NNT基因的篩查。此次篩查共發(fā)現(xiàn)了三例錯義突變,截止本研究結(jié)束時,這三個突變并未在CH患者中被報道過,這三個攜帶突變的患者表現(xiàn)出了明顯的甲狀腺功能減退,說明NNT基因可能是CH伴TD的候選致病基因,這豐富了CH的基因型-表型譜。此外,載有所發(fā)現(xiàn)三個突變的細(xì)胞并沒有表現(xiàn)出過氧化氫量的變化,但這三個突變改變了NNT蛋白的穩(wěn)定性,因此突變導(dǎo)致TD以及CH的具體致病機(jī)理仍需進(jìn)一步研究。
【圖文】：

上到下分別為人類、牛、貓、小鼠、大鼠和豬的 NNT 氨基酸序列。圖 A 矩形框為 p.A811G＞T）所在位置，圖 B 矩形框為 p.R693H（c.2078G＞A）所在位置，圖 C 矩形61M（c.2581G＞A）突變所在位置。圖 1.3 蛋白同源性比較.4 蛋白危害性預(yù)測PolyPhen2 預(yù)測結(jié)果顯示，三個突變均有可能對蛋白帶來危害。

注：自上到下分別為人類、牛、貓、小鼠、大鼠和豬的 NNT 氨基酸序列。圖 A 矩形框為 p.A271（c.811G＞T）所在位置，圖 B 矩形框為 p.R693H（c.2078G＞A）所在位置，圖 C 矩形框為p.V861M（c.2581G＞A）突變所在位置。圖 1.3 蛋白同源性比較1.4.4 蛋白危害性預(yù)測PolyPhen2 預(yù)測結(jié)果顯示，三個突變均有可能對蛋白帶來危害。
【學(xué)位授予單位】：青島大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R722.1

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 徐艷華;秦玉峰;趙正言;;中國新生兒先天性甲狀腺功能低下癥與苯丙酮尿癥篩查22年回顧[J];中華兒科雜志;2009年01期

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本文編號：2663946