發(fā)布時(shí)間：2020-05-12 12:53

【摘要】： 目的哺乳類雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)信號(hào)通路在細(xì)胞的生存、生長(zhǎng)與增殖中起中心調(diào)控作用，本研究用柯薩奇病毒B3m株(coxsackievirus B3m，CVB3m，CVB3)感染體外培養(yǎng)的SD大鼠心肌成纖維細(xì)胞和心肌細(xì)胞，建立病毒性心肌炎(viral myocarditis，VM)的細(xì)胞模型，用雷帕霉素(mpamycin)阻斷mTOR信號(hào)通路，了解mTOR信號(hào)通路在VM心肌纖維化的可能作用機(jī)制。 方法取新生SD鼠，用改良法原代培養(yǎng)心肌成纖維細(xì)胞和心肌細(xì)胞，根據(jù)細(xì)胞形態(tài)和免疫細(xì)胞化學(xué)染色對(duì)細(xì)胞進(jìn)行鑒定，建立CVB3感染的細(xì)胞模型。用mTOR抑制劑——雷帕霉素對(duì)細(xì)胞模型進(jìn)行干預(yù)，采用RT-PCR、Western Blot、免疫細(xì)胞化學(xué)染色等方法檢測(cè)細(xì)胞mTOR、eIF-4E、Ⅰ型膠原及Smad3表達(dá)，應(yīng)用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P＜0.05為差別有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果 (1)用胰蛋白酶與膠原酶合用消化分離心肌細(xì)胞，結(jié)合2次短時(shí)間的差速貼壁，可提高心肌細(xì)胞的存活率和搏動(dòng)率，純化心肌細(xì)胞和心肌成纖維細(xì)胞。心肌成纖維細(xì)胞抗波形蛋白(vimentin)染色陽(yáng)性，抗α-橫紋肌肌動(dòng)蛋白(α-sarcomeric actin)染色陰性；心肌細(xì)胞抗α-sarcomeric actin染色陽(yáng)性，抗vimentin染色陰性。 (2)CVB3感染心肌成纖維細(xì)胞，電鏡下細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，胞漿內(nèi)有病毒顆粒，心肌成纖維細(xì)胞CVB3 mRNA持續(xù)表達(dá)，重復(fù)感染率(multiplicity of infection，MOI)為1.0PFU／cell的CVB3可使心肌成纖維細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞病變(cytopathic effect，CPE)。CVB3可使原代培養(yǎng)的心肌細(xì)胞發(fā)生CPE，電鏡下細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，胞漿內(nèi)有病毒顆粒，培養(yǎng)上清液磷酸肌酸激酶-心型同工酶(CK-MB)及乳酸脫氫酶(LDH)水平增高。 (3)用0nM(對(duì)照組)、1nM、10nM、100nM的雷帕霉素干預(yù)心肌成纖維細(xì)胞48h，RT-PCR測(cè)得mTOR／β-actin光密度值分別為1.45±0.04、0.38±0.02、0.28±0.01、0.26±0.01，10nM組和100nM組低于1nM組，差異有顯著性(P＜0.05)；10nM組和100nM組比較，差異無(wú)顯著性(P＞0.05)；用10nM雷帕霉素干預(yù)心肌成纖維細(xì)胞0小時(shí)(對(duì)照組)、24h、48h、72h后RT-PCR測(cè)得mTOR／β-actin光密度值分別為0.34±0.02、0.20±0.02、0.16±0.02、0.14±0.01，光密度值隨雷帕霉素作用時(shí)間的延長(zhǎng)而降低，各組比較差異均有顯著性(P＜0.05)；將MOI分別為0(對(duì)照組)、0.2 PFU／cell、0.5 PFU／cell、1.0 PFU／cell的CVB3干預(yù)心肌成纖維細(xì)胞24 h，用MTT測(cè)得其OD值分別為0.36±0.04、0.35±0.05、0.66±0.07、0.32±0.065，MOI為0.5PFU／cell組OD值高于對(duì)照組(P＜0.05)；MOI為0.2PFU／cell和1.0PFU／cell組OD值與對(duì)照組比較差異均無(wú)顯著性(P＞0.05)；用10nM雷帕霉素干預(yù)CVB3感染的心肌成纖維細(xì)胞，MTT檢測(cè)其OD值，對(duì)照組、CVB3組、Rap組、CVB3+Rap組分別為0.55±0.09、0.66±0.09、0.42±0.09、0.36±0.12，CVB3組高于對(duì)照組，Rap低于對(duì)照組、CVB3+Rap組低于CVB3組，差異均有顯著性(P＜0.05)。 (4)RT-PCR檢測(cè)對(duì)照組心肌成纖維細(xì)胞mTOR／β-actin光密度值d1、d2、d3分別為：0.36±0.03、0.39±0.02、0.37±0.04，各時(shí)間點(diǎn)比較差異均無(wú)顯著性(P＞0.05)；CVB3組光密度值d1、d2、d3分別為：0.86±0.06、0.97±0.06、0.93±0.06，各時(shí)間點(diǎn)比較差異均無(wú)顯著性(P＞0.05)；CVB3+Rap組d1、d2、d3光密度值分別為：0.26±0.03、0.18±0.02、0.10±0.02，各時(shí)間點(diǎn)比較，光密度值隨干預(yù)時(shí)間的延長(zhǎng)而降低，d3降低最明顯，與d1、d2比較，，差異有顯著性(P＜0.05)。CVB3組光密度值各時(shí)間點(diǎn)與對(duì)照組對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)比較，d1開(kāi)始增加，d2、d3仍可見(jiàn)增加，差異均有顯著性(P＜0.05)；CVB3+Rap組光密度值各時(shí)間點(diǎn)與CVB3組對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)比較降低，差異均有顯著性(P＜0.05)；Western Blot檢測(cè)mTOR蛋白表達(dá)，對(duì)照組、CVB3組、Rap組、CVB3+Rap組mTOR／β-actin灰度值分別為0.22±0.09、0.92±0.13、0.19±0.03、0.20±0.05。CVB3組高于對(duì)照組，Rap組低于照組、CVB3+Rap組低于CVB3組，差異均有顯著性(P＜0.05)。 (5)RT-PCR檢測(cè)心肌成纖維細(xì)胞eIF-4E／β-actin光密度值，對(duì)照組、CVB3組、Rap組、CVB3+Rap組分別為：0.73±0.07、0.87±0.03、0.32±0.03、0.56±0.04；Western Blot檢測(cè)上述各組eIF-4E／β-actin灰度值分別為：0.79±0.09、1.35±0.12、0.55±0.04、0.62+0.07，CVB3組高于對(duì)照組，Rap組低于對(duì)照組、CVB3+Rap組低于CVB3組，差異均有顯著性(P＜0.05)。 (6)RT-PCR檢測(cè)心肌成纖維細(xì)胞Ⅰ型膠原／β-actin光密度值，對(duì)照組、CVB3組、Rap組、CVB3+Rap組分別為：1.13±0.06、1.30±0.01、0.73±0.03、0.82±0.03，CVB3組高于對(duì)照組，Rap組低于對(duì)照組、CVB3+Rap組低于CVB3組，差異均有顯著性(P＜0.05)；心肌成纖維細(xì)胞Ⅰ型膠原免疫細(xì)胞化學(xué)染色呈陽(yáng)性，胞漿呈淺棕黃色，胞核為藍(lán)色。CVB3感染細(xì)胞48 h，胞漿呈深棕色，雷帕霉素干預(yù)后胞漿顏色變淺。 (7)RT-PCR檢測(cè)心肌成纖維細(xì)胞Smad3／β-actin光密度值，對(duì)照組、CVB3組、Rap組、CVB3+Rap組分別為：0.63±0.06、1.18±0.03、0.35±0.05、0.77±0.08；Western Blot檢測(cè)上述各組Smad3／β-actin灰度值分別為：0.89±0.07、2.27±0.13、0.36±0.02、0.13±0.01。CVB3組高于對(duì)照組，Rap組低于對(duì)照組、CVB3+Rap組低于CVB3組，差異均有顯著性(P＜0.05)。 (8)RT-PCR檢測(cè)心肌細(xì)胞mTOR／β-actin光密度值，對(duì)照組、CVB3組、Rap組、CVB3+Rap組分別為：0.32±0.08、0.93±0.06、0.15±0.05、0.32±0.08；Western Blot檢測(cè)上述各組mTOR／β-actin灰度值分別為：0.79±0.11、2.97±0.23、0.45±0.08、1.23±0.19。CVB3組高于對(duì)照組，Rap組低于對(duì)照組、CVB3+Rap組低于CVB3組，差異均有顯著性(P＜0.05)。 (9)RT-PCR檢測(cè)eIF-4E／β-actin光密度值，對(duì)照組、CVB3組、Rap組、CVB3+Rap組分別為：0.80±0.03、1.21±0.09、0.45±0.04、0.44±0.06；Western Blot檢測(cè)上述各組eIF-4E／β-actin灰度值分別為：1.22±0.09、2.52±0.31、0.66±0.03、0.99±0.11。CVB3組高于對(duì)照組，Rap組低于對(duì)照組、CVB3+Rap組低于CVB3組，差異均有顯著性(P＜0.05)。 (10)RT-PCR檢測(cè)心肌細(xì)胞Ⅰ型膠原／β-actin光密度值，對(duì)照組、CVB3組、Rap組、CVB3+Rap組分別為：0、0.18±0.06、0、0.06±0.02，對(duì)照組及Rap組光密度值均為0，CVB3組高于對(duì)照組，CVB3+Rap組低于CVB3組，差異均有顯著性(P＜0.05)。 (11)RT-PCR檢測(cè)心肌細(xì)胞Smad3／β-actin光密度值：對(duì)照組、CVB3組、Rap組、CVB3+Rap組分別為0.55±0.04、1.14±0.05、0.41±0.10、0.35±0.07；Western Blot檢測(cè)上述各組Smad3／β-actin灰度值分別為：0.11±0.01、0.35±0.09、0.06±0.01、0.08±0.02。CVB3組高于對(duì)照組，Rap組低于對(duì)照組、CVB3+Rap組低于CVB3組，差異均有顯著性(P＜0.05)。 結(jié)論 (1)低濃度的胰蛋白酶和膠原酶合用，結(jié)合2次差速貼壁分離培養(yǎng)大鼠心肌細(xì)胞，可提高心肌細(xì)胞的存活率和純度，使細(xì)胞搏動(dòng)良好。 (2)心肌成纖維細(xì)胞可作為CVB3的感染細(xì)胞建立VM細(xì)胞模型。 (3)雷帕霉素使心肌成纖維細(xì)胞內(nèi)源性mTOR表達(dá)下調(diào)，在一定劑量?jī)?nèi)，呈劑量和時(shí)間依賴性，mTOR可作為雷帕霉素作用的靶點(diǎn)。 (4)雷帕霉素抑制CVB3誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞成纖維細(xì)胞增殖是通過(guò)mTOR／eIF-4E信號(hào)通路起作用的。 (5)雷帕霉素抑制CVB3可誘導(dǎo)心肌成纖維細(xì)胞Ⅰ型膠原及Smad3表達(dá)，提示mTOR／eIF-4E信號(hào)通路與Smad信號(hào)通路共同作用，參與CVB3誘導(dǎo)的心肌纖維化過(guò)程。 (6)CVB3可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞Ⅰ型膠原表達(dá)，雷帕霉素抑制CVB3誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞mTOR、eIF-4E、Ⅰ型膠原及Smad3表達(dá)，提示心肌細(xì)胞在CVB3感染時(shí)細(xì)胞表型可能發(fā)生改變，并通過(guò)mTOR／eIF-4E及Smad信號(hào)通路在纖維化過(guò)程中起一定作用。
【圖文】：

mTOR(387bp)100bP圖3一2不同濃度雷帕霉素對(duì)心肌成纖維細(xì)胞 mTORmRNA表達(dá)的影響(RT-PCR)l:對(duì)照組 ;2:1nM;3:10nM;4:100nM 10nM組和 100nM組抑制作用較InM組強(qiáng)，差異有顯著性護(hù)<0.05);而 10nM組和100nM組比較，差異無(wú)顯著性護(hù)卜0.05)3.1.2不同時(shí)間點(diǎn)雷帕霉素對(duì)心肌成纖維細(xì)胞mTOR表達(dá)的影響用 10IIM雷帕霉素干預(yù)心肌成纖維細(xì)胞oh(對(duì)照組)、24h、48h、72h后RT一pCR檢測(cè)mToR/p一actin光密度值分別是0.34士0.02、0.2肚0.02、0.1肚0.02、0.1牡0.01。 mTORmRNA表達(dá)隨雷帕霉素作用時(shí)間的增加而降低，差異均有顯著性(p<0.05)(見(jiàn)圖3一3，34)。 0.4 0.35 0.3 0.25 0.2abe 0.15華趙娜架巴切幾!岌 0.05對(duì)照組24h48h72h圖3一3不同時(shí)間點(diǎn)雷帕霉素對(duì)心肌成纖維細(xì)胞 mTORmRNA表達(dá)的影響(mTOR/卜actin光密度值)經(jīng)方差分析和￡阿天勺檢驗(yàn):介364.44月.000，“與對(duì)照組比較P<0.05;”與24h組比較，;c與48h組比較尸 <0.05

mTOR 10()bP圖3一82大、不同時(shí)間點(diǎn)雷帕霉素對(duì)CvB3感染的心肌成纖維細(xì)胞mTOR表達(dá)的影響(RT-PcR)對(duì)照組;2:CvB3組;3:CVB3+R即組;dl、d2、d3分別表示干預(yù)后第I大、第第3大時(shí)間點(diǎn)。CvB3使心肌成纖維細(xì)胞mTOR表達(dá)增加，雷帕霉素抑制其表達(dá)。 3.4.2WestcmBlot檢測(cè)心肌成纖維細(xì)胞mTOR蛋白表達(dá)用 10nM雷帕霉素干預(yù)CVB3感染的心肌成纖維細(xì)胞48h， WestemBlot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)各組均在289切處有陽(yáng)性條帶出現(xiàn)，mTO側(cè)p一actin灰度值分別為0.2肚0.09、0.9肚0.13、0.1妊0.03、0.2肚0.05，CvB3組高于對(duì)照組，Rap組低于對(duì)照組、CVB3+Rap組低于CVB3組，差異均有顯著性(F=166.695，尸<0.05)(見(jiàn)圖3一9)。 1234一翻.
【學(xué)位授予單位】：中南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號(hào)】：R725.4

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2660248