【摘要】：研究背景 腎母細胞瘤(nephroblastoma)又名。腎胚胎瘤、wiims瘤(WT),是兒童最常見的腹膜后實體腫瘤之一。自90年代以來,腫瘤手術切除率近于100.0%,5年生存率達到80.0%。由于腎母細胞瘤為先天性疾病,發(fā)病年齡較低,兒童又有其自身特點無法及時準確感知病情,目前尚無行之有效的早期檢測手段。臨床實踐證明,如果能夠及早發(fā)現(xiàn),及時治療,部分術后的腎母細胞瘤患兒可達到臨床治愈、長期存活的療效。目前腎母細胞瘤主要依靠臨床癥狀和超聲檢查、CT、泌尿系平片、靜脈腎盂造影等影像學手段,但這些檢查手段只有當腫瘤長到一定大小時才能被發(fā)現(xiàn),敏感性差。此外,當前尚未發(fā)現(xiàn)腎母細胞瘤診斷特異性強的生物學標記物。因此,探索一種簡單、快速、敏感性高和特異性強的新方法具有重要的臨床意義。 腎母細胞瘤的發(fā)生是多基因多階段多因素的動力學過程,是癌基因激活和抑癌基因失活的結果,涉及到多個基因,基因突變或調控異常時,細胞內的蛋白質在成份和數(shù)量上都會有相應的改變,通過對蛋白質的動態(tài)觀察可以了解腫瘤是否復發(fā)或轉移的動態(tài)變化。蛋白質組學的發(fā)展為腫瘤預后監(jiān)測提供了新的方法和技術平臺。體外培養(yǎng)的細胞株雖然不能完全反映體內細胞的生長狀態(tài)和生物學活性,但它具有成分單一,均質性好,實驗條件容易控制等優(yōu)點。尤其在做對比性研究時可避免由組織細胞成分復雜,細胞異質性高等缺點造成的結果不真實和不可靠。 蛋白質組學的表面增強激光解吸電離—飛行時間質譜(Surface EnhancedLaser Desorption/Ionizayion Time of Flight-Mass Spectrometry,SELDI-TOF-MS)技術是近年開發(fā)的新型蛋白質組學技術,它應用基因芯片的設計原理,把層析、質譜等技術合理地與蛋白質芯片結合,可檢測出傳統(tǒng)方法難以鑒定的蛋白質和多肽,是發(fā)現(xiàn)蛋白質標記物的理想方法,具有快速、靈敏、高通量等特點。目前已經運用SELDI-TOF-MS技術篩選出了腎母細胞瘤患兒的特異性血清蛋白標記物,并建立了早期診斷、腫瘤分期、術后及預后監(jiān)測的診斷模型,本研究應用SELDI-TOF-MS技術分析腎母細胞瘤細胞株、正常胚腎細胞株和腎母細胞瘤患兒術前、術后血清中的差異蛋白,檢測出差異的蛋白質表達,進一步探討用于腎母細胞瘤早期診斷的特異性蛋白質標記物,以建立高特異性和敏感性的腎母細胞瘤診斷模型,同時評價該模型對腎母細胞瘤診斷的應用價值。 研究目的 檢測腎母細胞瘤細胞特異的蛋白質標記物,構建用于腎母細胞瘤早期診斷及鑒別診斷的蛋白質圖譜模型。 材料與方法 1.1材料 腎母細胞瘤細胞株(G401)和正常胚腎細胞株(CCC-HEK-1)均購自中國協(xié)和醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院細胞中心。腎母細胞瘤患者血清標本100例(術前30例、術后70例),均來自鄭州大學第一附屬醫(yī)院小兒外科,所有腎母細胞瘤均經免疫組化和2名以上病理學教授證實。 1.2主要試劑和儀器 胎牛血清購自杭州四季清生物有限公司。F12培養(yǎng)液購自中國協(xié)和醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院細胞中心。胰蛋白酶購自杭州吉諾生物醫(yī)藥技術有限公司。RPMI-1640培養(yǎng)基購自GIBCO公司。標準分子量蛋白marker購自MBI公司�？捡R斯亮蘭G-250(Coomassie brilliant blueG-250)購自美國Ameresco公司。BP121S型分析天平購自德國Sartorious公司。Hera CO_2培養(yǎng)箱購自德國GMBH公司。倒置顯微鏡購自日本Nikon公司。超聲細胞粉碎機購自寧波新芝生物股份有限公司。紫外分光光度計Thermo Helios購自美國熱電公司。乙酸鈉、尿素、NaAC、SPA(Sinapinic acid)、HPLC水、CHAPS均購自美國Promega公司。表面增強激光解析電離-飛行時間質譜(Surface Enhanced Laser Desorption/Ionization Time of Flight-Mass Spectrometry,SELDI-TOF-MS)PBSⅡ(主要參數(shù):收集范圍為1000 Da-50000 Da;優(yōu)化范圍為2000 Da-20000 Da。)和弱陽離子蛋白質交換芯片(WCX2)購自美國Ciphergen Biosystems公司。蛋白質芯片WCX2表面結合有弱型陰離子羧基,可以被分析物表面的正電荷基團相互作用(如賴氨酸、精氨酸、組氨酸等)而捕獲蛋白,可用于檢測高等電點的蛋白質和生物標記分子。應用軟件:Proteinchip Software 3.2.0和Biomarker Wizard軟件。 1.3方法 1.3.1患者血清的收集所有腎母細胞瘤患兒術前、術后外周靜脈全血標本均于清晨空腹抽取,4℃靜置1 h后以3000 rpm離心10 min,分離出的血清儲存于-86℃低溫冰箱中,術前編號為xq1-xq30,術后編號為xh1-xh70。 1.3.2細胞總蛋白質的提取G401細胞采用含20%胎牛血清的F12培養(yǎng)液培養(yǎng),CCC-HEK-1細胞采用含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng),細胞鋪滿瓶底后,用胰蛋白酶使細胞與培養(yǎng)瓶分離提取細胞懸液;置入4℃,低溫離心機1000 rpm,5 min,棄去上清液,加入PBS液,吹打均勻,反復離心、清洗3次后,加入裂解液200μl,吹打混勻,上超聲粉碎機充分裂解后,4℃,低溫離心機12000 rpm,20 min,提取上清液,采用分光光度計測定上清的蛋白濃度,G401細胞裂解液用裂解液調至樣品濃度為2g/L,CCC-HEK-1細胞裂解液用裂解液調至樣品濃度為1g/L,分裝-86℃儲存。G401細胞收獲3次,CCC-HEK-1細胞收獲2次,以排除組間差別。 1.3.3 WCX2蛋白質芯片操作步驟將標本置冰浴中解凍,100 mmol/L NaAC(PH=4)稀釋后,和Bioprocessor預處理過的WCX2蛋白質芯片結合反應60 min,上述NaAC緩沖液清洗芯片,取出芯片風干后點50%飽和的SPA溶液,將芯片放入SELDI讀譜儀中檢測。 1.3.4數(shù)據(jù)采集和結果分析蛋白質芯片采用PBSⅡ-C型讀取數(shù)據(jù),用已知分子量的蛋白質芯片將SELDI-TOF-MS系統(tǒng)校正到分子量誤差小于0.1%。分析參數(shù):激光強度為170,靈敏度為6,每個樣本收集總點數(shù)140次。收集數(shù)據(jù)范圍1000 Da-30000 Da,優(yōu)化范圍2000 Da-20000 Da。每份樣品至少在芯片3個不同點進行檢測,以排除不同芯片點之間的差異。 1.3.5統(tǒng)計學處理 采用Proteinchip Software3.2.0版本的分析軟件自動采集數(shù)據(jù),質譜原始數(shù)據(jù)經Biomarker Wizard過濾噪音,聚類分析處理后,對初步篩選出的質荷比峰數(shù)據(jù)做Wilconxon秩和檢驗,檢驗標準取α=0.01。每個m/z峰對樣本區(qū)分的差異顯著性不同。按照P值的大小可以比較每個質荷比峰在各樣本中中表達差異的顯著性程度。P值越小說明這個質荷比峰對區(qū)分兩類樣本越有意義。 兩個蛋白峰比較時,差異蛋白定義為蛋白峰強度相差一倍以上。相似蛋白為:如患者血清和體外培養(yǎng)蛋白質對比,質荷比相同即可;如體外培養(yǎng)蛋白質之間對比,不僅質荷比相同,且蛋白峰的強度相差一倍以下。采用SPSS13.0進行統(tǒng)計學分析,兩樣本均數(shù)比較采用獨立樣本t檢驗,多樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析及q檢驗,取α=0.05為檢驗標準,即P＜0.05有統(tǒng)計學意義。以質量控制蛋白質芯片做重復性檢測,其峰值的大小及其相對強度的變異系數(shù)(cv)均控制在0.05%和15%以下,具有良好的重復性。 結果 1.利用WCX2芯片分析腎母細胞瘤細胞裂解液與正常胚腎細胞裂解液之間存在的蛋白質表達差異采用PBSⅡ-C型蛋白質芯片閱讀機自動收集數(shù)據(jù),設有意義峰的信噪比(signal/noise)大于5,試驗結果表明,WCX2芯片發(fā)現(xiàn)G401、CCC-HEK-1細胞差異峰共19個,其中4287 Da、4839 Da、4984 Da、5016 Da、5322 Da、5427 Da、5930 Da、8569 Da、10095 Da、10411 Da、10844 Da、12765Da蛋白質分子在腎母細胞瘤細胞G401中高表達,3020 Da、3150 Da、4083 Da、4435 Da、4705 Da、5491 Da、6881 Da蛋白質分子在正常胚腎細胞CCC-HEK-1中高表達。 2.利用WCX2芯片分析腎母細胞瘤細胞(G401)裂解液與小兒腎母細胞瘤患兒術前血清之間存在的蛋白質表達差異采用PBSⅡ-C型蛋白質芯片閱讀機自動收集數(shù)據(jù),設有意義峰的信噪比(signal/noise)大于5,試驗結果表明,WCX2芯片發(fā)現(xiàn)G401與小兒腎母細胞瘤術前血清中存在五處相似蛋白質,分別為4633Da、5051 Da、6143 Da、8569 Da、9295 Dao 3.利用WCX2芯片分析腎母細胞瘤細胞(G401)裂解液與小兒腎母細胞瘤患兒術后血清之間存在的蛋白質表達差異采用PBSⅡ-C型蛋白質芯片閱讀機自動收集數(shù)據(jù),設有意義峰的信噪比(signal/noise)大于5,試驗結果表明,WCX2芯片發(fā)現(xiàn)G401與小兒腎母細胞瘤術后血清中存在十三處相似蛋白質,分別為4100 Da、4290 Da、4298 Da、4394 Da、4504 Da、4548 Da、4634 Da、4800 Da、5267 Da、5495 Da、5763 Da、g570 Da、9296 Da。 結論 表面增強激光解析電離飛行時間質譜技術結合細胞生物學檢測腎母細胞瘤細胞株、腎母細胞瘤患兒血清的差異蛋白質表達,進一步探討用于腎母細胞瘤早期診斷的特異性蛋白質標記物,以建立高特異性和敏感性的腎母細胞瘤診斷模型,同時評價該模型對腎母細胞瘤診斷的應用價值。
【圖文】：

血清的F12培養(yǎng)液反復吹打，將細胞吹打均勻，1:2傳代。 1.2.1.2CCC一HEK-1細胞培養(yǎng)CCC一HEK-1細胞培養(yǎng)采用含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)(圖2)，5%co:，37℃玻璃培養(yǎng)瓶中貼壁培養(yǎng)，常規(guī)12卜24h觀察換液，72h后傳代，加入0.25%的胰蛋白酶消化液，，37℃恒溫下靜置約 2min，倒掉消化液，加入含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液反復吹打

’腎母細胞瘤細胞株G401細胞(40xlo倍顯微鏡下)
【學位授予單位】：鄭州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2009
【分類號】：R737.11

【參考文獻】

相關期刊論文 前9條

1 王家祥,李守淼,李琦,范應中;腎母細胞瘤組織中組織蛋白酶D、尿激酶型纖溶酶原激活劑及其受體的表達[J];鄭州大學學報(醫(yī)學版);2004年02期

2 王家祥,馮林,李琦,范應中;腎母細胞瘤組織中PTEN、NF-κB和Ki-67的表達[J];鄭州大學學報(醫(yī)學版);2004年02期

3 王家祥,夏宗江,宋再,范應中,葉啟發(fā);腎母細胞瘤組織中DNA倍體、SPF、增殖細胞指數(shù)的測定[J];鄭州大學學報(醫(yī)學版);2004年02期

4 陳堯,李瑞祥,王若菡,劉執(zhí)玉;人直腸腺癌血管內皮細胞NFκBp65表達的意義[J];華西醫(yī)科大學學報;2001年02期

5 肖雪媛,劉丹慧,劉博,何大澄;體外培養(yǎng)的不同亞型肝癌細胞差異蛋白的初步篩查[J];解剖學報;2004年06期

6 鄒高德,葛根,孫錫林;腎細胞癌bcl-2及ki-67的免疫組化研究[J];江西醫(yī)學院學報;2002年01期

7 李穗生,劉唐彬,蘇誠,李桂生;新生兒腹部實體腫瘤[J];中華小兒外科雜志;2005年09期

8 丁守怡,錢冬萌,閆志勇,宋旭霞,牟文鳳,王斌;蛋白質芯片飛行質譜技術檢測體外培養(yǎng)的肝癌細胞株與轉染HBV的肝癌細胞株蛋白質的差異表達[J];世界華人消化雜志;2005年14期

9 王家祥;張蛟;劉秋亮;王利;范應中;余捷凱;鄭樹;;基于支持向量機對腎母細胞瘤患者血清蛋白質標記物的檢測分析[J];中華醫(yī)學雜志;2006年42期

本文編號：2659200