【摘要】：大量的流行病學(xué)和實(shí)驗(yàn)室研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)宮內(nèi)生長(zhǎng)遲緩(IUGR)患者或低出生體重兒與成人期發(fā)生的疾病如2型糖尿病、肥胖、代謝綜合癥、骨質(zhì)疏松、高血壓、冠狀動(dòng)脈疾病、慢性腎病等密切相關(guān)并可以遺傳至下一代,此即“成人疾病的發(fā)育起源”學(xué)說或Barker假說。越來越多的證據(jù)揭示了表觀調(diào)控機(jī)制在胎兒來源的成人疾病中起到重要作用。表觀遺傳學(xué)是研究不涉及DNA序列改變的基因表達(dá)和調(diào)控的可遺傳修飾,包括DNA甲基化、組蛋白修飾、RNA干擾、遺傳印跡等。檢測(cè)DNA甲基化與組蛋白修飾的表觀遺傳學(xué)方法主要由重亞硫酸鹽測(cè)序技術(shù)和染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP)技術(shù)。目前IUGR相關(guān)的成人期疾病發(fā)生的表觀遺傳調(diào)控機(jī)制已經(jīng)有了初步的認(rèn)識(shí),然而,由宮內(nèi)不同環(huán)境所誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈高壓中是否存在表觀遺傳調(diào)控尚不清楚。鑒于現(xiàn)有的資料,我們假設(shè)： 1.宮內(nèi)不良環(huán)境所致的新生兒肺動(dòng)脈高壓存在著相關(guān)基因的表觀遺傳修飾的改變。 2.孕期飲食限制所致的IUGR可以引起肺動(dòng)脈高壓相關(guān)基因的表觀遺傳修飾改變,并可持續(xù)到成年；而且這些表觀改變可以引起個(gè)體對(duì)低氧等刺激因素高度敏感,導(dǎo)致肺動(dòng)脈高壓的發(fā)生。如果在個(gè)體發(fā)育早期階段給予適當(dāng)?shù)母深A(yù)措施,阻止或逆轉(zhuǎn)IUGR誘導(dǎo)的相關(guān)基因的表觀修飾,可能對(duì)降低成年后發(fā)生肺動(dòng)脈高壓有保護(hù)作用。 第一部分新生兒持續(xù)性肺動(dòng)脈高壓內(nèi)皮細(xì)胞的表觀調(diào)控機(jī)制 .目的： 新生兒持續(xù)性肺動(dòng)脈高壓(PPHN)是指生后肺血管阻力持續(xù)性增高,肺動(dòng)脈壓超過體循環(huán)動(dòng)脈壓使由胎兒型循環(huán)過渡至正�！俺扇恕毙脱h(huán)發(fā)生障礙導(dǎo)致右向左分流,臨床表現(xiàn)為嚴(yán)重的低氧血癥。肺血管內(nèi)皮細(xì)胞由內(nèi)皮型一氧化氮合成酶(eNOS)產(chǎn)生的一氧化氮(NO)在PPHN的發(fā)病中有重要作用,而內(nèi)皮細(xì)胞eNOS的表達(dá)是受到表觀遺傳調(diào)控的。本研究的目的是探索eNOS基因在PPHN發(fā)病中的表觀遺傳調(diào)控機(jī)制。 方法： 1.大鼠PPHN模型由低氧加消炎痛共同誘導(dǎo)建立。 2.新生大鼠肺血管內(nèi)皮細(xì)胞由磁珠激活的細(xì)胞分選技術(shù)(MACS)分離獲得。Real-time PCR和Western blot用于檢測(cè)eNOS基因的表達(dá)水平,染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP)、重亞硫酸鹽測(cè)序技術(shù)用于分析eNOS基因的表觀調(diào)控。 結(jié)果： 1. PPHN大鼠模型的評(píng)估：左室游離壁加室間隔與右室的比重在低氧加消炎痛聯(lián)合組明顯增加。與其它組相比,聯(lián)合處理組的肺小動(dòng)脈中層厚度百分率增加最為顯著；外膜彈力蛋白所占比率以及內(nèi)膜eNOS免疫染色也明顯增加；α-SMA、彈力蛋白(elastin)、eNOS蛋白表達(dá)水平以及血漿腦型利尿肽(BNP)水平也是顯著增加。 2. PPHN大鼠肺血管內(nèi)皮細(xì)胞(PVEC)中eNOS基因近端啟動(dòng)子區(qū)域的組蛋白H3和H4乙�；矫黠@高于正常對(duì)照組；PPHN的eNOS基因啟動(dòng)子總甲基化率雖比對(duì)照組要低,但兩組之間無顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。eNOS基因的表觀修飾改變與增加的eNOS mRNA和蛋白水平相一致。 結(jié)論： 1.低氧和消炎痛對(duì)大鼠肺血管重構(gòu)有協(xié)同作用,由兩者聯(lián)合誘導(dǎo)的PPHN大鼠模型可以模擬人的PPHN. 2.大鼠PPHN中增加的eNOS蛋白表達(dá)與該基因啟動(dòng)子區(qū)域增加的組蛋白乙�；胶涂赡艿腄NA低甲基化密切相關(guān)。 3.表觀遺傳調(diào)控可能是PPHN的發(fā)病機(jī)制之一。 第二部分宮內(nèi)生長(zhǎng)遲緩誘導(dǎo)成年期肺動(dòng)脈高壓內(nèi)皮細(xì)胞的表觀調(diào)控機(jī)制 目的： 宮內(nèi)不同環(huán)境所致的宮內(nèi)生長(zhǎng)遲緩(IUGR)可以引起生后不同程度的肺動(dòng)脈高壓或者肺血管重構(gòu),然而,由IUGR誘導(dǎo)的生命后期的肺動(dòng)脈高壓或肺血管變化的發(fā)病機(jī)制尚不清楚。由于內(nèi)皮素-1(ET-1)在肺高壓的發(fā)病中至關(guān)重要,我們假設(shè)IUGR可引起ET-1基因的表觀修飾改變,這種修飾改變可以持續(xù)到成年期并能導(dǎo)致其在生后對(duì)低氧高度敏感；而且生后早期給予適當(dāng)?shù)母深A(yù)措施能夠降低這種成年期疾病發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。 方法： 1.大鼠IUGR模型、低氧模型和TSA早期干預(yù)模型的建立。 2.肺動(dòng)脈壓力、肺血管重構(gòu)的評(píng)估,PVEC的分離。Western blot用于評(píng)估ET-1蛋白的表達(dá),染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)用于分析ET-1基因的組蛋白修飾和轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合程度。 結(jié)果： 1.正常6周對(duì)照組大鼠和IUGR大鼠的右心室平均收縮壓(RVSP)分別為21.6±2.08 mmHg和22.93±1.60 mmHg,兩組之間無明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。經(jīng)低氧處理后,兩組的RVSP明顯增加,而且IUGR hypoxia組大鼠RVSP較Control hypoxia組升高明顯；IUGR hypoxia組大鼠肺動(dòng)脈中膜厚度的百分率、中膜面積的百分率明顯大于年齡匹配的對(duì)照組。但經(jīng)組蛋白去乙�；敢种苿㏕richostatin A (TSA)干預(yù)后,兩組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。低氧處理后兩組大鼠肺組織α-SMA蛋白表達(dá)則明顯增加,尤以IUGR組增加更為顯著。 2.低氧干預(yù)后IUGR組ET-1蛋白表達(dá)水平則明顯高于對(duì)照組,兩者具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。IUGR大鼠生后1天和6周的ET-1基因核心啟動(dòng)子區(qū)域組蛋白H3和H3K9/18乙�；矫黠@高于對(duì)照組,而H4改變不明顯；但低氧干預(yù)后H3、H3K9/18和H4的乙�；絼t均明顯增加。。同樣,IUGR大鼠ET-1基因啟動(dòng)子上轉(zhuǎn)錄因子HIF-1α的富集程度與H3的改變相似。 結(jié)論： 1.低氧誘導(dǎo)IUGR大鼠產(chǎn)生顯著的肺高壓、肺血管重構(gòu)以及增加的ET-1蛋白表達(dá)。 2. IUGR的低氧反應(yīng)特性與ET-1基因核心啟動(dòng)子區(qū)域增加的組蛋白乙酰化程度和轉(zhuǎn)錄因子HIF-1α的富集密切相關(guān)。IUGR生后早期TSA干預(yù)后可以減輕生命后期由低氧誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈高壓與肺血管重構(gòu)。 3.表觀遺傳調(diào)控可能是IUGR誘導(dǎo)的肺高壓的發(fā)病機(jī)制之一。
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R722.1

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2659191