【摘要】： 目的結(jié)核性腦膜炎(tuberculous meningitis，TM)是小兒時期一種嚴(yán)重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病。其病死率為20％～50％，幸存者中有20％～30％留有永久性神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥。TM發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，診斷困難，預(yù)后較差。蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)是近年來出現(xiàn)的一種研究特定細(xì)胞、組織或完整生物體所表達(dá)的全部蛋白質(zhì)及其活動規(guī)律的新興學(xué)科。本實驗通過該技術(shù)建立正常中國兒童及TM患兒腦脊液(cerebrospinal fluid，CSF)蛋白質(zhì)雙向凝膠電泳圖譜，篩選TM特異性蛋白，為TM的早期診斷提供線索，同時也為其發(fā)病機(jī)制的深入了解提供新思路。 方法收集TM急性期、TM治療1個月后及正常對照組兒童CSF各5ml，三氯乙酸(trichloracetic acid，TCA)沉淀法獲取CSF總蛋白質(zhì)，固相PH梯度(immobile PH gradient，IPG)二維聚丙烯酰胺凝膠電泳(two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis，2D-PAGE)技術(shù)分離蛋白質(zhì)，考馬斯亮藍(lán)染色，Imagescanner掃描儀以及LabScan掃描軟件對凝膠進(jìn)行掃描獲取圖像。利用圖像分析軟件PDQuest 7.0，以正常兒童CSF的2-DE凝膠為參考膠，將TM急性期CSF的凝膠與之進(jìn)行比較分析，尋找兩組CSF蛋白質(zhì)譜的異常變化斑點。再以TM急性期CSF凝膠為參考膠，將TM治療1個月后CSF凝膠與之比較分析，觀察差異蛋白質(zhì)斑點的變化情況。篩選出分辨清楚、僅在TM急性期CSF中表達(dá)的蛋白質(zhì)斑點，切取后進(jìn)行基質(zhì)輔助激光解吸附電離飛行時間質(zhì)譜(Matrix-assisted laser desorption／ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS)分析，獲得肽質(zhì)量指紋圖譜(Peptide mass fingerprinting，PMF)，運用生物信息學(xué)技術(shù)獲取蛋白的基本信息，確定差異蛋白質(zhì)。 結(jié)果正常兒童CSF分離獲得蛋白質(zhì)斑點533個，TM急性期CSF分離獲得蛋白質(zhì)斑點546個，其中有14個蛋白質(zhì)點僅在正常CSF表達(dá)，27個蛋白質(zhì)點僅在TM急性期CSF中表達(dá)，在TM急性期高豐度表達(dá)的蛋白質(zhì)點，在TM治療1個月后CSF中表達(dá)量均下調(diào)與正常CSF蛋白質(zhì)點表達(dá)量比較，TM急性期有15個蛋白質(zhì)點表達(dá)量有2倍以上的上調(diào)，而8個蛋白質(zhì)點表達(dá)量有2倍以上的下調(diào)。共選出20個差異蛋白質(zhì)點進(jìn)行MALDI-TOF-MS分析，獲得了20張PMF。進(jìn)入數(shù)據(jù)庫進(jìn)行搜索后匹配到蛋白質(zhì)的點有16個，發(fā)現(xiàn)載脂蛋白A-I、免疫球蛋白J鏈、人多克隆免疫球蛋白M冷凝集素Fab片段、免疫球蛋白λ輕鏈VLJ區(qū)、MGC31936蛋白、免疫球蛋白λ輕鏈可變區(qū)、抗腫瘤壞死因子α抗體、免疫球蛋白G1 A鏈Fab片段、免疫球蛋白KC、HLA-Ⅱ類抗原DRB1-4、PRO2675蛋白、MRP14蛋白在TM急性期CSF中特異性表達(dá)。 結(jié)論本實驗首次成功建立了正常兒童CSF與TM患兒CSF的雙向凝膠電泳圖譜。通過凝膠圖像分析和計算機(jī)信息處理，發(fā)現(xiàn)了一些與TM相關(guān)的蛋白質(zhì)差異位點。經(jīng)質(zhì)譜分析及生物信息學(xué)技術(shù)初步鑒定了部分差異蛋白質(zhì)，發(fā)現(xiàn)載脂蛋白A-I、抗腫瘤壞死因子α抗體、HLA-Ⅱ類抗原DRB1-4、MRP14蛋白可能與TM的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，這些蛋白能否成為TM診斷的標(biāo)記物，值得進(jìn)一步的研究。
【圖文】：

質(zhì)譜使用基質(zhì)峰和胰蛋白酶自動降解離子峰作為內(nèi)對照進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)校正。每個蛋白樣品分別測定3次的質(zhì)譜峰，采用 DataexPforer軟件分析，顯示的質(zhì)譜峰界面如圖2一2所示。10U如 VOyagerSPee口1舊P一2湘02，242061，決扣刀21朋祖60團(tuán)匆延。解一畏19加871q2297刀ZB矍黔C37741501望豁也靈罵蠕潤掃悶34D57猛獷.赫、圖2一 2MALDI一TOF一MS膚質(zhì)量指紋圖譜(X軸為m/z;Y軸為相對強(qiáng)度)2.2.6.3生物信息學(xué)通過 MascotDistiner軟件掃描質(zhì)譜峰的高度和坐標(biāo)值，將上述數(shù)據(jù)輸入Mascot數(shù)據(jù)庫中搜索(~.matrixscience.com)，檢索時各主要參數(shù)設(shè)置(表2一22):①數(shù)據(jù)庫應(yīng)用:swiss一Prot或NeB玩;②被鑒定樣品的來源(speeies)，人類;③獲得膚片段所選用的酶(enzyme)，胰蛋白酶;④修飾半膚氨酸所采用的試劑，脈甲基(carbamidomethyl一cys);⑤用于搜尋的質(zhì)量與理論質(zhì)量之間可允許的誤差范圍 (PePtideMassToleranee)

第三章結(jié)果 3.1TM組CSF圖譜與正常組CSF圖譜比較正常組與TM組CSFZ一DE圖譜見圖3一1、圖3一2、圖3一3。選擇圖3一1作為參考膠，將圖3一2與其進(jìn)行匹配。再選擇圖3一2作為參考膠，將圖3一3與其進(jìn)行匹配。結(jié)果測得正常組CSF有蛋白質(zhì)斑點533個，，TM急性期CSF有蛋白質(zhì)斑點546個。有14個蛋白質(zhì)點僅在正常CSF中表達(dá)(圖3一4)，有27個蛋白質(zhì)點僅在TM急性期CSF中表達(dá)(圖3一5)，這27個在TM急性期高豐度表達(dá)的蛋白質(zhì)點，在TM治療1個月后表達(dá)量均下調(diào)(圖3一3);與正常CSF蛋白質(zhì)點表達(dá)量比較，TM急性期CSF有8個蛋白質(zhì)點表達(dá)量有2倍以上的下調(diào)(圖3一6)
【學(xué)位授予單位】：中南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號】：R725.3

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4 張雷;王s

本文編號：2652467