【摘要】： 研究背景;細菌性腦膜炎,也稱化膿性腦膜炎,是一種嚴重危害兒童和成人健康的感染性疾病。它是由各種化膿菌引起的以腦膜炎癥為主的中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病。發(fā)病率與年齡有關,嬰幼兒多見,2歲以內(nèi)發(fā)病者約占本病的75%,發(fā)病高峰年齡6～12個月。主要臨床特征是發(fā)熱、頭痛、嘔吐、驚厥、意識障礙、腦膜刺激征陽性及腦脊液化膿性改變。隨著抗生素和糖皮質(zhì)激素的廣泛使用,本病的發(fā)病率已明顯減少,但仍有較高的死亡率和致殘率。近30%的病人威脅生命,并有高達50%的存活者留有不同程度的神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥。因此研究細菌性腦膜炎的病理生理機制,研究在細菌性腦膜炎病理生理過程中起腦保護作用的因素和加重腦損害作用的因素及其機制,可以有助于提高腦保護因素而降低腦損害因素,從而改善細菌性腦膜炎的預后。動物模型的建立為人們研究細菌腦膜炎的病理生理機制提供了便利條件。近年來的研究顯示,炎性刺激因子如革蘭氏陰性菌的脂多糖和革蘭氏陽性菌的肽聚糖可以激活I-κB激酶NF-κB通路和3絲裂原激活的蛋白激酶(MAPK),而后一系列轉(zhuǎn)錄因子被激活,如NF-κB(p50/p65)、cFos/cJun,它們又協(xié)調(diào)多種炎癥介質(zhì)基因的表達。蛋白酪氨酸激酶(PTKs)和蛋白酪氨酸磷酸酶(PTPases)分別對蛋白酪氨酸殘基起著磷酸化和脫磷酸的作用。已知蛋白酪氨酸殘基的磷酸化控制著體內(nèi)很多重要的生理過程,包括細胞的增殖和分化。SHP1、SHP2是哺乳動物兩種重要的胞漿PTPases,它們均有氨基端兩個SH2區(qū)和羧基端一個磷酸酶區(qū)。SH2區(qū)決定反應的特異性。雖然兩者結(jié)構(gòu)有極大的相似性,但作用卻是相反的。SHP1在信號轉(zhuǎn)導中主要起負調(diào)控作用,起抑制細胞增殖和分化的作用,而SHP2在細胞信號轉(zhuǎn)導中主要起正調(diào)控作用即促進信號轉(zhuǎn)導,起促進細胞增殖和分化的作用。SHP2還參與Ras-Raf-MAPK信號通路的激活。SHP1的負向調(diào)節(jié)和SHP2的正向調(diào)節(jié)作用間可能既存在拮抗,又保持動態(tài)平衡,此平衡的改變將影響細胞的增殖分化及信號轉(zhuǎn)導。如在實驗性腦缺血損傷中,SHP1和SHP2在反應性激活的星形膠質(zhì)細胞中表達均升高。SHP2被認為控制著膠質(zhì)細胞從成熟靜止型向激活型的轉(zhuǎn)變,SHP1則被認為限制著損傷誘導的膠質(zhì)細胞的過度增殖。因為細菌性腦膜炎時的炎性刺激因子和SHP2激活相同的信號轉(zhuǎn)導通路,所以SHP2有可能參與細菌性腦膜炎的炎癥反應。因為在肺炎鏈球菌腦膜炎的基因圖譜中,已證實SHP1的表達在炎癥的急性期是升高的,所以我們認為SHP2在細菌性腦膜炎中的表達也應該是升高的。為證實這一假設,我們建立了幼齡大鼠細菌性腦膜炎的模型,研究了SHP2在鼠腦基因轉(zhuǎn)錄和蛋白水平的表達及與腦脊液白細胞計數(shù)、TNF-alpha濃度的關系,并用酪氨酸磷酸酶抑制劑原釩酸鈉(SOV)抑制SHP2及酪氨酸磷酸酶的活性,以觀察其對細菌性腦膜炎腦損害程度的影響,以探討SHP2及酪氨酸磷酸酶在細菌性腦膜炎中的作用。 材料與方法;①研究對象;3周齡清潔級Wistar大鼠共101只。58只大鼠被隨機分為腦膜炎組(n=48)和對照組(n=10),腦膜炎組再根據(jù)不同的處死時間分為4個小組,分別為接種后1天、3天、7天和14天組。43只腦膜炎大鼠被分為原釩酸鈉(SOV)干預組(n=20)和生理鹽水組(n=23),其中SOV組和生理鹽水組各8只于腦膜炎恢復后進行水迷宮測試,其余27只行病理學觀察。②幼鼠細菌性腦膜炎的誘導;參照劉心潔和Leib的方法,小腦延髓池穿刺,移去50μl腦脊液,然后注入50μl濃度為3-9×10~5cfu/ml的肺炎鏈球菌懸液,對照組注入50μl滅菌生理鹽水。感染后18h,取腦脊液少量于綿羊血瓊脂糖培養(yǎng)基上培養(yǎng)24小時以證實腦膜炎的形成。③組織處理;動物處死前抽取腦脊液50-100μl以檢測腦脊液TNF-alpha濃度和進行白細胞計數(shù)。左心灌注PBS后,做RT-PCR和Western blot檢測的鼠腦分離大腦皮層和海馬,迅速放入-80℃冰箱中備用。做免疫組化和病理學觀察的鼠腦用4%多聚甲醛灌注后,再用4%多聚甲醛固定1-3天,后換至30%蔗糖溶液中直至組織塊下沉。做冠狀面冷凍切片,貼于防脫玻片上,晾干后存于-20℃冰箱中備用。④檢測方法;SHP2基因轉(zhuǎn)錄水平的檢測采用RT-PCR的方法,依次經(jīng)過總RNA提取、cDNA的合成和PCR反應等步驟。SHP2mRNA的定量采用與看家基因beta-actin的mRNA水平進行比較的方法進行測量。SHP2蛋白水平的檢測采用Western blot的方法,依次經(jīng)過總蛋白提取、SDS-PAGE電泳、電轉(zhuǎn)膜、抗原抗體反應和顯色等步驟。SHP2蛋白的定量采用與beta-actin的蛋白水平相比較的方法進行測量。SHP2在鼠腦的免疫組化染色采用三步法(SP法),依次經(jīng)過抗原修復、清除內(nèi)源性過氧化物酶、山羊血清封閉、滴加一抗、滴加二抗、DAB顯色、復染及脫水透明、封片。腦脊液TNF-alpha含量測定采用放免法,操作嚴格按說明書進行。⑤27只腦膜炎大鼠被隨機分為原釩酸鈉組(n=12)和對照組(n=15)。SOV組在腦池內(nèi)注入細菌同時按2ml/kg腹腔注射濃度為27mmol/1PH值為7.4的原釩酸鈉溶液,每日1次,共注射7天。對照組腹腔注射同等劑量的滅菌生理鹽水(2ml/kg)并持續(xù)相同時間。觀察兩組大鼠臨床結(jié)果、外周血和腦脊液白細胞計數(shù)、腫瘤壞死因子濃度和腦組織損傷評分的差異。⑥原釩酸鈉組和生理鹽水組各8只大鼠于細菌接種后第21天開始進行水迷宮測試以觀察對空間學習記憶能力的影響,為期4天。計算每天各組大鼠到達平臺的平均時間。⑦所得計量資料以均數(shù)±標準差表示,t檢驗作兩組均數(shù)間比較,單因素方差分析基礎上q檢驗作多組均數(shù)間兩兩比較,非正態(tài)分布資料采用Kruskal-Wallis檢驗或Wilcoxon檢驗。兩變量的相關性采用Pearson相關系數(shù)。率的比較采用Fisher's檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。 結(jié)果; 1.腦膜炎組大鼠腦脊液均培養(yǎng)出與接種同株的肺炎鏈球菌(腦膜炎組大鼠腦脊液培養(yǎng)的細菌與接種的肺炎鏈球菌同株)且有較高的細菌滴度,對照組大鼠腦脊液無細菌生長。 2.腦膜炎大鼠輕者僅表現(xiàn)為精神稍差、吃食少,重者表現(xiàn)為精神差、嗜睡、反應遲鈍,有的表現(xiàn)為轉(zhuǎn)圈、翻跟頭等。腦膜炎組腦組織可見蛛網(wǎng)膜下腔、腦室和軟腦膜中性粒細胞、纖維蛋白滲出。皮質(zhì)損害表現(xiàn)為白細胞聚集和神經(jīng)元壞死,且皮層損害主要見于鼠腦的基底面即腹側(cè)面,背側(cè)面未見明顯皮質(zhì)損害。正常對照組未見病理損害。 3.腦膜炎模型組皮層SHP2mRNA表達水平于腦膜炎第3天達到高峰,達0.200±0.049,約為正常對照的5倍。腦膜炎第7天,皮層SHP2mRNA水平有輕度下降,為0.129±0.032,但與對照組相比仍有顯著差異(P＜0.05)。第14天,皮層SHP2mRNA水平已降至正常。 4.腦膜炎模型組皮層SHP2蛋白表達于腦膜炎第3天,開始明顯升高,達0.678±0.041,與對照組相比已有顯著性差異(P＜0.05)。腦膜炎第7天,皮層SHP2蛋白水平達到高峰,為1.181±0.042,接近正常對照的9倍。第14天,皮層SHP2蛋白表達仍維持在較高水平,為0.556±0.071,與對照組相比仍有顯著性差異(P＜0.01)。 5.免疫組化染色顯示,SHP2免疫反應陽性細胞廣泛分布于正常大鼠和腦膜炎大鼠的皮層,神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞均見陽性表達。與正常對照相比,腦膜炎大鼠第三腦室周圍SHP2陽性染色細胞明顯增多,從形態(tài)上看多為膠質(zhì)細胞。 6.與正常對照組相比,腦膜炎大鼠腦脊液TNF-alpha濃度明顯升高(分別為1.55±0.1 ng/ml、2.47±0.68 ng/ml,P＜0.005),白細胞計數(shù)明顯增加(分別為120±40/μl、1586±1152/μl,P＜0.005)。SHP2的蛋白表達量與腦脊液白細胞計數(shù)呈顯著正相關(r=0.77,P＜0.001),而與腦脊液TNF-alpha濃度無明顯相關性。 7.應用酪氨酸磷酸酶抑制劑原釩酸鈉(SOV)明顯提高了腦膜炎大鼠腦脊液中TNF-alpha的濃度[SOV組(n=12)為4.51±1.22ng/ml,生理鹽水組(n=15)為1.99±0.31ng/ml,P＜0.001],增加了腦組織損傷評分[SOV組中位數(shù)為42(36-48),生理鹽水組為18(12-24),P＜0.02],而對外周血和腦脊液白細胞計數(shù)無明顯影響。腦膜炎恢復后,SOV干預組大鼠平均到達平臺時間較生理鹽水組明顯延長[分別為(23.8±3.6)s、(19.5±4.2)s,P＜0.05]。 結(jié)論; 1腦池內(nèi)注入3-9×10~5 cfu/ml的肺炎鏈球菌懸液可以成功地建立肺炎鏈球菌腦膜炎模型。 2在細菌性腦膜炎中,蛋白酪氨酸磷酸酶SHP2的表達無論在基因轉(zhuǎn)錄水平還是蛋白水平均明顯升高。 3蛋白酪氨酸磷酸酶SHP2的蛋白表達量與腦脊液白細胞計數(shù)呈顯著正相關,而與腦脊液TNF-alpha濃度無明顯相關性,說明SHP2在細菌性腦膜炎的發(fā)病機制中并不發(fā)揮重要的作用,但可作為病情變化的觀察指標。 4蛋白酪氨酸磷酸酶抑制劑原釩酸鈉抑制SHP2及總蛋白酪氨酸磷酸酶的活性后,提高了腦膜炎大鼠腦脊液中TNF-alpha的濃度,加重了腦膜炎大鼠的腦組織病理損害和大鼠空間學習記憶能力的損害,證明了蛋白酪氨酸磷酸酶,特別是SHP2在細菌性腦膜炎中有一定的腦保護作用。
【圖文】：

圖1腦膜炎大鼠腦脊液肺炎鏈球菌培養(yǎng)陽性，，奧潛eontrolld14d7d3deontr01ld14d止5(lbP3(卜()卜「-圖ZSHPZ基因的RT一PCR凝膠電泳結(jié)果SHPZC(們士rol

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【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2007
【分類號】：R725.1

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本文編號：2652441