發(fā)布時(shí)間：2020-05-05 16:32

【摘要】： 臨床上多種腎臟疾病不論其最初的發(fā)病因素如何，若慢性進(jìn)展，則腎間質(zhì)纖維化(renal interstitial fibrosis，RIF)是它們的共同通路，最終會(huì)發(fā)展為終末期腎臟疾病(end stage renal disease，ESRD)。目前已經(jīng)明確轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)是一種最重要的促腎臟纖維化因子，既可以活化腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞，也可以使腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生表型改變，使它們轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂屑〖?xì)胞表型的肌成纖維細(xì)胞，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞周期失衡而無限制增生，并表達(dá)大量細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)，這是腎小管間質(zhì)損傷發(fā)生、發(fā)展至RIF的重要機(jī)制之一，因此尋找RIF過程中的負(fù)調(diào)控因子，進(jìn)行早期干預(yù)，減輕或阻止腎小管間質(zhì)損傷從而減緩腎臟病慢性進(jìn)展已經(jīng)成為腎臟病領(lǐng)域研究的熱門話題。 研究表明多種RIF過程中的負(fù)調(diào)控因子如肝細(xì)胞生長因子(hepatocytegrowth factor，HGF)等可以通過抑制TGF-β1而發(fā)揮抗纖維化作用。黃文彥等以單側(cè)輸尿管梗阻(unilateral ureteral obstruction，UUO)方法建立RIF大鼠模型，檢測(cè)腎組織的基因表達(dá)譜時(shí)發(fā)現(xiàn)抗增殖蛋白(Prohibitin，PHB)基因明顯下調(diào)并推測(cè)其為介導(dǎo)RIF的重要基因之一。已知PHB基因是一種近年來發(fā)現(xiàn)的腫瘤抑制基因，它所編碼的PHB蛋白結(jié)構(gòu)保守，在細(xì)胞代謝、生長、衰老以及凋亡等諸多方面發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。但關(guān)于PHB在正常以及病變腎組織中的表達(dá)規(guī)律，以及關(guān)于PHB是否可以影響TGF-β1所誘導(dǎo)的腎臟成纖維細(xì)胞生物學(xué)行為變化及其分子機(jī)制，國內(nèi)外均未見報(bào)道。為此我們進(jìn)行了以下三部分的研究，以初步探討PHB在腎小管間質(zhì)損傷的作用地位。 第一部分抗增殖蛋白在兒童腎小管間質(zhì)中的表達(dá)及意義 目的：觀察不同程度腎小管間質(zhì)損傷的患兒腎活檢組織中抗增殖蛋白(Prohibitin，PHB)的表達(dá)以及分布規(guī)律，探討PHB表達(dá)與腎小管間質(zhì)損傷之間的關(guān)系。對(duì)象與方法：選取不同病因和類型的原發(fā)性腎小球腎炎患兒腎活檢標(biāo)本48例，其中病理類型為微小病變(MCNS)9例，系膜增生性腎炎(MsPGN)12例，局灶節(jié)段性腎小球硬化(FSGS)5例，膜性腎病(MN)4例，IgA腎病(IgAN)18例，并以9例正常的腎組織標(biāo)本作為對(duì)照。根據(jù)常規(guī)染色光鏡下腎小管間質(zhì)的病變分組，分級(jí)結(jié)果為：0級(jí)22例，1級(jí)13例，2級(jí)12例，3級(jí)10例。以免疫組織化學(xué)方法分別檢測(cè)各組標(biāo)本PHB和α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)的表達(dá)，并將PHB陽性表達(dá)指數(shù)與α-SMA陽性表達(dá)指數(shù)、腎小管間質(zhì)損傷程度、患兒腎小球?yàn)V過率(glomerular filtration rate，GFR)及尿乙酰-β-D葡萄糖苷酶(urinary N-acetyl-β-D-glucosamccharase，NAG)水平進(jìn)行比較。 結(jié)果：正常腎組織中PHB蛋白質(zhì)陽性表達(dá)，程度由髓質(zhì)向皮質(zhì)逐步減弱，主要表達(dá)于腎小管上皮細(xì)胞及部分間質(zhì)細(xì)胞，而血管陰性；在腎小球系膜細(xì)胞弱陽性，腎小球上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞未見表達(dá)。隨著腎小管間質(zhì)損傷程度的加重，上述細(xì)胞PHB的表達(dá)逐漸減弱，表達(dá)范圍也發(fā)生了一定的變化，損傷嚴(yán)重的腎小管上皮細(xì)胞和增生明顯的間質(zhì)細(xì)胞幾乎不表達(dá)PHB，腎小球系膜細(xì)胞亦陰性。不同分級(jí)腎小管間質(zhì)PHB蛋白質(zhì)陽性表達(dá)指數(shù)兩兩比較有顯著性差異(F=82.6，P＜0.01)。α-SMA蛋白在損傷腎間質(zhì)區(qū)域表達(dá)增強(qiáng)，在管腔破壞和萎縮的腎小管上皮細(xì)胞明顯表達(dá)。不同分級(jí)腎小管間質(zhì)α-SMA蛋白質(zhì)陽性表達(dá)指數(shù)兩兩比較有顯著性差異(F=90.5，P＜0.01)。根據(jù)線性回歸分析，腎小管間質(zhì)中PHB、α-SMA表達(dá)量之間負(fù)相關(guān)(r=-0.756，P＜0.01)，在損傷的腎小管間質(zhì)中，PHB與忠兒尿NAG水平之間顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.802，P=0.003)，與患兒GFR水平無相關(guān)性(r=-0.447，P=0.232)。Spearman等級(jí)相關(guān)分析顯示，腎小管間質(zhì)損傷程度與PHB表達(dá)量顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.802，P=0.003)，與α-SMA表達(dá)量顯著正相關(guān)(r=0.765，P=0.006)。 結(jié)論：人類正常腎組織存在著一定程度的PHB蛋白質(zhì)表達(dá)，在損傷腎小管間質(zhì)中PHB表達(dá)降低，PHB蛋白表達(dá)水平與腎小管間質(zhì)損傷程度負(fù)相關(guān)，與尿NAG水平顯著負(fù)相關(guān)，，提示PHB很可能是與腎小管間質(zhì)損傷有關(guān)的一種新的重要指標(biāo)。 第二部分抗增殖蛋白抑制TGF-β1誘導(dǎo)的腎臟成纖維細(xì)胞增殖、表型改變和細(xì)胞外基質(zhì)表達(dá) 目的：觀察抗增殖蛋白(Prohibitin，PHB)對(duì)腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞增殖、表型變化及表達(dá)細(xì)胞外基質(zhì)等生物學(xué)行為的影響并探討機(jī)制。 對(duì)象與方法：(1)觀察PHB在大鼠腎臟成纖維細(xì)胞(normal renal kidneyfibroblasts，NRK-49F)中亞細(xì)胞定位，以Western印跡和RT-PCR測(cè)定NRK-49F細(xì)胞受到TGF-β1作用后PHB表達(dá)的變化。(2)從NRK-49F細(xì)胞中擴(kuò)增大鼠PHB基因全長的cDNA，構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒，測(cè)序成功后轉(zhuǎn)染NRK-49F細(xì)胞；觀察轉(zhuǎn)染PHB質(zhì)粒對(duì)NRK-49F細(xì)胞周期和細(xì)胞生長曲線的影響。(3)觀察轉(zhuǎn)染PHB質(zhì)粒對(duì)NRK-49F細(xì)胞表達(dá)α-SMA、細(xì)胞外基質(zhì)纖連蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)、Ⅲ型膠原(collagen typeⅢ，ColⅢ)以及基質(zhì)金屬蛋白酶-1(matrixmetalloproteinase-1，MMP-1)蛋白質(zhì)和mRNA表達(dá)的影響。 結(jié)果：(1)激光共聚焦顯微鏡下見PHB主要分布于NRK-49F的細(xì)胞質(zhì)，細(xì)胞核亦有比較弱的表達(dá)。加入TGF-β1后NRK-49F細(xì)胞中PHB蛋白和mRNA表達(dá)均明顯下調(diào)，并且呈現(xiàn)時(shí)間依賴關(guān)系和劑量依賴關(guān)系。(2)成功構(gòu)建PHB真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(-)／PHB，重組質(zhì)粒經(jīng)測(cè)序所得887bp的目的片段與Genebank中的原序列(BC097304)100％符合。Western印跡結(jié)果顯示，對(duì)數(shù)生長期NRK-49F細(xì)胞有PHB蛋白基礎(chǔ)表達(dá)，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后PHB表達(dá)升高約2.54倍(與空白對(duì)照組相比，P＜0.01)，而轉(zhuǎn)入空載體的細(xì)胞PHB的表達(dá)與未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞比較無明顯變化(P＞0.05)，提示轉(zhuǎn)染成功。(3)TGF-β1可以明顯刺激NRK-49F細(xì)胞增殖，使更多的細(xì)胞脫離G0／G1期而進(jìn)入S期和G2／M期(與空白對(duì)照組相比，P＜0.01)，轉(zhuǎn)染PHB質(zhì)粒可以明顯抑制TGF-β1誘導(dǎo)的增殖，使更多的細(xì)胞維持于G0／G1期(與TGF-β1組比較，P＜0.01)，而對(duì)未受到TGF-β1的細(xì)胞生長則無影響(與空白對(duì)照組相比，P＞0.05)。TGF-β1明顯刺激NRK-49F細(xì)胞生長，轉(zhuǎn)染PHB質(zhì)�？梢悦黠@抑制TGF-β1誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖，24-48h之間抑制最明顯，24h時(shí)增殖抑制率27％，48h時(shí)增殖抑制率達(dá)48％，72h時(shí)增殖抑制率仍有35％，而對(duì)未受到TGF-β1的NRK-49F細(xì)胞生長幾乎無影響(與空白對(duì)照組相比，P＞0.05)。(4)空白組NRK-49F細(xì)胞不表達(dá)α-SMA蛋白和mRNA，TGF-β1刺激NRK-49F細(xì)胞表達(dá)α-SMA，并呈現(xiàn)時(shí)間和劑量依賴關(guān)系，轉(zhuǎn)染PHB基因可明顯抑制TGF-β1所誘導(dǎo)的α-SMA蛋白和mRNA表達(dá)(與TGF-β1組比較，P＜0.01)，而對(duì)細(xì)胞中α-SMA的基礎(chǔ)表達(dá)無影響(與空白對(duì)照組相比，P＞0.05)。TGF-β1刺激NRK-49F細(xì)胞后FN、ColⅢ和MMP-1 mRNA表達(dá)上調(diào)，分別為對(duì)照組的1.80倍、2.04倍和1.77倍；預(yù)先轉(zhuǎn)染PHB基因可以抑制TGF-β1誘導(dǎo)的FN和ColⅢmRNA表達(dá)上調(diào)，抑制率分別為44％和46％(與TGF-β1組比較，Ps＜0.01)，但對(duì)MMP-1mRNA表達(dá)無影響(與TGF-β1組比較，P＞0.05)。TGF-β1刺激NRK-49F細(xì)胞中FN、ColⅢ、MMP-1和E2F1蛋白表達(dá)上調(diào)，分別為對(duì)照組1.68倍、2.14倍、1.87倍和1.64倍；預(yù)先轉(zhuǎn)染PHB基因可以抑制TGF-β1誘導(dǎo)的FN、ColⅢ和E2F1蛋白質(zhì)表達(dá)上調(diào)，抑制率為30％、47％和44％(與TGF-β1組比較，P＜0.01)，但對(duì)MMP-1蛋白表達(dá)無影響(與TGF-β1組比較，P＞0.05)。 結(jié)論：NRK-49F細(xì)胞中有內(nèi)源性PHB表達(dá)，主要分布于細(xì)胞質(zhì)，細(xì)胞核亦有較弱表達(dá)；TGF-β1可以使NRK-49F中PHB表達(dá)下調(diào)；外源性PHB顯著抑制TGF-β1所誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞增殖、表型改變和表達(dá)細(xì)胞外基質(zhì)，提示PHB可能成為防治RIF的新靶點(diǎn)。 第三部分抗增殖蛋白通過抑制Smad3核轉(zhuǎn)位而拮抗TGF-β1對(duì)腎臟成纖維細(xì)胞的誘導(dǎo) 目的：探討抗增殖蛋白(Prohibitin，PHB)拮抗TGF-β1對(duì)腎臟成纖維細(xì)胞的誘導(dǎo)的分子生物學(xué)機(jī)制。 對(duì)象與方法：NRK-49F細(xì)胞生長至80％融合時(shí)轉(zhuǎn)染或不轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(-)／PHB質(zhì)粒，12h后換用無血清DMEM培養(yǎng)基，饑餓24h再加入或不加入1ng／ml TGF-β1，繼續(xù)孵育30min或48h，收獲細(xì)胞。以Western印跡方法檢測(cè)細(xì)胞總蛋白中Smad7和磷酸化Smad3的表達(dá)，以免疫共沉淀檢測(cè)細(xì)胞總蛋白中與Smad2／3結(jié)合的Smad4的量；分別抽提細(xì)胞漿與細(xì)胞核，以Western印跡方法檢測(cè)細(xì)胞核中磷酸化Smad3的表達(dá)量。 結(jié)果：(1)TGF-β1處理后NRK-49F細(xì)胞中磷酸化Smad3的表達(dá)量明顯增多(與空白對(duì)照組相比，P＜0.01)，轉(zhuǎn)染PHB質(zhì)粒對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的Smad3磷酸化無影響(與TGF-β1組比較，P＞0.05)；TGF-β1處理以及轉(zhuǎn)染PHB質(zhì)粒對(duì)NRK-49F細(xì)胞中Smad7表達(dá)水平無影響(與空白對(duì)照組相比，Ps＞0.05)。(2)免疫共沉淀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)TGF-β1處理后細(xì)胞中與Smad2／3結(jié)合的Smad4表達(dá)量增多(與空白對(duì)照組相比，P＜0.01)，轉(zhuǎn)染PHB質(zhì)粒對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的Smad4和Smad2／3結(jié)合無影響(與TGF-β1組比較，P＞0.05)。(3)TGF-β1處理后NRK-49F細(xì)胞中核蛋白磷酸化Smad3的表達(dá)量明顯增多(與空白對(duì)照組相比，P＜0.01)，轉(zhuǎn)染PHB質(zhì)�？梢越档秃说鞍字辛姿峄疭mad3的表達(dá)量(與TGF-β1組比較，P＜0.01)。 結(jié)論：PHB對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的Smad3磷酸化、Smad7表達(dá)量以及與Smad3結(jié)合的Smad4的量均無影響，但是能夠抑制TGF-β1誘導(dǎo)的Smad3入核，提示PHB很可能是通過抑制活化的Smad3發(fā)生核轉(zhuǎn)位而拮抗TGF-β1對(duì)腎臟成纖維細(xì)胞的誘導(dǎo)。 總結(jié) 1、首次發(fā)現(xiàn)人腎組織表達(dá)PHB蛋白，主要分布于一些間充質(zhì)來源細(xì)胞如腎小管上皮細(xì)胞和腎間質(zhì)細(xì)胞，PHB蛋白表達(dá)水平與腎小管間質(zhì)損傷程度反向相關(guān)； 2、NRK-49F細(xì)胞有內(nèi)源性PHB表達(dá)，主要分布于細(xì)胞質(zhì)中，細(xì)胞核里亦有較弱表達(dá)； 3、受TGF-β1作用后NRK-49F細(xì)胞中PHB蛋白和mRNA表達(dá)均下調(diào)，外源性PHB抑制TGF-β1誘導(dǎo)的NRK-49F增殖，使細(xì)胞周期停滯于G0／G1期，可以抑制TGF-β1誘導(dǎo)的NRK-49F表型變化并減少分泌細(xì)胞外基質(zhì)表達(dá)，但不影響MMP1的表達(dá)； 4、PHB可以抑制活化的Smad3發(fā)生核轉(zhuǎn)位，這很可能是PHB拮抗TGF-β1對(duì)腎臟成纖維細(xì)胞的誘導(dǎo)活化的關(guān)鍵所在，因此PHB有可能成為減緩腎臟疾病慢性進(jìn)展的一種新的分子靶標(biāo)。
【圖文】：

表達(dá)明顯降低，分化時(shí)PHB表達(dá)明顯升高，基因轉(zhuǎn)染過量表達(dá)PHB可抑制人白血病細(xì)胞、前列腺癌細(xì)胞等進(jìn)入細(xì)胞增殖周期，基因干擾PHB表達(dá)則可促進(jìn)上述細(xì)胞增殖【35一371。圖1顯示目前所知道的有關(guān)PHB的信號(hào)通路，還存在許多問號(hào)等待我們?nèi)ソ獯穑�存在許多問題需要我們?nèi)ヲ?yàn)證。鑒于PHB具有明顯的抗細(xì)胞增殖作用，同時(shí)基因芯片檢測(cè)結(jié)果也發(fā)現(xiàn)纖維化大鼠腎組織PHB基因表達(dá)明顯下調(diào)，提示這種下調(diào)很有可能參與了租F的發(fā)生發(fā)展，然而PHB在正常以及病變腎組織中的分布、表達(dá)規(guī)律以及是否與具有腎臟保護(hù)作用，尚未檢索到國內(nèi)外有相關(guān)報(bào)道。為了研究PHB基因及其表達(dá)產(chǎn)物在腎臟纖維化過程中的表達(dá)以及變化規(guī)律，探討PHB在RIF發(fā)生發(fā)展中的意義

圖2:TGF一印使NRK一49F細(xì)胞中PHB蛋白和mRNA表達(dá)下調(diào)。A:以相同劑量(0.2nmol/L)的各種生長因子刺激細(xì)胞48h;B:PHB蛋白表達(dá)的劑量依賴曲線，作用時(shí)間為48h;c:PHB蛋白表達(dá)的時(shí)間依賴曲線，TGF一pl劑量為1ng八nl;D:PHBmRNA表達(dá)的劑量依賴曲線，作用時(shí)間為48h。*，與對(duì)照組比較，尸<0.01，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號(hào)】：R726.9

【引證文獻(xiàn)】

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1 彭單單;覃遠(yuǎn)漢;邵明斌;周添標(biāo);徐會(huì)凌;程會(huì)元;雷鳳英;周春;黃韋芳;;Prohibitin1和Prohibitin2在缺氧性腎小管上皮細(xì)胞損傷中的表達(dá)及作用[J];實(shí)用兒科臨床雜志;2012年05期

本文編號(hào)：2650441